БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 6, с. 688-694
УДК 582.282.123.4:577.152.344
ВОЗДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕАЗ МИКРОМИЦЕТОВ РОДА ASPERGILLUS НА БЕЛКИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
© 2014 г. А. А. Осмоловский*, #, Е. С. Звонарева*, В. Г. Крейер*, Н. А. Баранова*, Н. С. Егоров**
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119234, Москва
**Международный биотехнологический центр Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва Поступила в редакцию 29.04.2014 г. Принята к печати 07.05.2014 г.
Проведен скрининг среди микромицетов рода Aspergillus на предмет секреции ими внеклеточных протеолитических ферментов, способных воздействовать на белки системы гемостаза человека. Обнаружена способность внеклеточных протеаз аспергиллов расщеплять специфичные для белков системы гемостаза хромогенные пептидные субстраты, а также активировать ряд проферментов (протеин С, Х фактор и протромбин). Впервые показана способность внеклеточных протеаз микромицетов активировать Х фактор плазмы крови человека.
Ключевые слова: внеклеточные протеазы микромицетов, протеазы-активаторы белков системы гемостаза.
DOI: 10.7868/S0132342314060128
ВВЕДЕНИЕ
Система гемостаза осуществляет совокупность реакций, направленных на поддержание постоянной вязкости крови, тромбообразование и предотвращение кровотечений. В основе этих реакций лежит конверсия одних белков-проферментов в активные протеазы путем ограниченного протеолиза и протеолитическое расщепление других белков [1]. Такие реакции весьма специфичны, происходят с разрывом конкретных пептидных связей. Однако помимо протеаз, циркулирующих в кровотоке человека и животных, существуют протеазы, образуемые микроорганизмами, в том числе микро-мицетами, способные осуществлять подобные реакции расщепления или активации белков системы гемостаза [2].
Мицелиальные грибы, в частности микроми-цеты рода Aspergillus, способны синтезировать комплекс внеклеточных протеолитических ферментов с разной субстратной специфичностью, различными оптимумами рН- и термоактивности [3]. Известно, что многие микромицеты образуют
Сокращения: ПТК — протромбиновый комплекс; Glp — пироглутаминовая кислота; Z — N-бензилоксикарбонил; Bz — бензоил; Tos — тозил; Pip — пиперозил; pNA — п-нит-роанилид.
#Автор для связи (тел.: +7 (495) 939-27-72; эл. почта: aosmol@mail.ru).
протеазы, воздействующие на систему гемостаза человека. Так, прямой фибринолитической (плаз-миноподобной) активностью обладают представители многих родов сапротрофных и энтомопатоген-ных микромицетов. Протеазы с активаторной к плазминогену активностью образуют, например, Arthrohotrys longa и Trichotecium roseum, индуцируя таким образом реакции лизиса тромбов, а некоторые виды микромицетов рода Acremonium образуют протеазы с активаторной активностью к протромбину, которая вызывает свертывание крови [4, 5]. В последнее время, на примере Aspergillus ochraceus, была показана способность внеклеточных протеаз, образуемых мицелиаль-ными грибами, проявлять антикоагулянтную активность, выражающуюся в активации протеина С плазмы крови человека [6]. Наличие активатор-ной активности к белкам плазмы крови указывает на способность таких протеаз осуществлять реакции ограниченного протеолиза [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Способность образовывать протеазы, воздействующие на белки системы гемостаза человека, была проверена у 7 культур микромицетов рода Aspergillus: A. alliaceus 7dN1, A. nidulans 203, A. ochraceus L-1, A. sclerotiorum 1, A. terreus 2, A. ver-
воздействие внеклеточных протеаз микромицетов
689
+S1 Культуральная жидкость +плазма
+S2
+S2
Расщепление субстрата
Расщепление субстрата не происходит
Отсутствие прямой активности
Расщепление субстрата
Рис. 1. Схема эксперимента по выявлению прямой и активаторной к белкам системы гемостаза активности внеклеточных протеаз в культуральной жидкости микромицетов.
Протеаза аспергилла + протеин С ^ Активированный протеин С Активированный протеин С + 01р-Рго-Аг§-рМА ^ О1р-Рго-Аг§-Ои + рМА-И
Протеаза аспергилла + протромбин ^ Тромбин Тромбин + Н-^-РЬе-Р1р-АгБ-рМА ^ И-£-РЬе-Р1р-Аг§-ОИ + рМА-И
Протеаза аспергилла + X ^ X Ха + 7-^-АгБ-а1у-АгБ-рМА ^ 7-£-Аг§-а1у-Аг§-ОИ + рМА-И
Рис. 2. Предполагаемая схема реакций по расщеплению протеазами аспергиллов специфических хромогенных субстратов.
яюоЬг 1, А. 48148 1. Выявление активностей проводили с помощью хромогенных пептидных субстратов, расщепляемых различными белками системы гемостаза: И-^0-\&1-Ьеи-Ьу5-рМА ^-2251) — субстрат плазмина, В2-Пе-01и^)-01у-Аг§-рМА ^-2222) и 2-/)-Аг§-01у-Аг§-рМА ^-2765) — субстраты Ха фактора плазмы крови человека, С1р-Рго-Аг§-рМА ^-2366) — субстрат активированного протеина С, 01р-01у-Аг§-рМА ^-2444) — субстрат урокина-зы, И-^-РИе-Р1р-АгЕ-рМА @-2238) и Т^-Иу-Рго-Аг§-рМА (СЬгошо8уш-ТИ) — субстраты тромбина.
На рис. 1 представлена схема эксперимента по выявлению активности внеклеточных протеназ культуральной жидкости аспергиллов — прямой активности (с каким-либо хромогенным пептидным субстратом S1, без добавления в инкубационную смесь плазмы крови человека) и актива-торной активности (с добавлением в инкубационную смесь плазмы в случае, если активность культуральной жидкости с другим хромогенным субстратом — S2 — не проявляется). При обнаружении активаторной активности с S2 речь может идти о реакции ограниченного протеолиза белков плазмы крови.
При определении активаторной активности протеаз аспергиллов к важнейшим белкам системы гемостаза — протеину С, фактору X и протромбину руководствовались следующей гипоте-
зой: если внеклеточные протеазы микромицетов способны активировать соответствующие белки, содержащиеся в плазме, то продукты их активации — активированный протеин С, фактор Xa и тромбин, будут расщеплять специфичные для них хромогенные субстраты — п-нитроанилиды, по аргинину с высвобождением в раствор свободного я-нитроанилина (рис. 2).
Как видно из полученных результатов определения прямой и активаторной активности протеаз аспергиллов к белкам системы гемостаза (табл. 1), протеазы, образуемые аспергиллами, могут оказывать комплексное воздействие на белки системы гемостаза: проявлять плазминоподобную и тром-биноподобную активности, а также активатор-ную — к протеину С, протромбину и X фактору. Причем плазминоподобной и тромбиноподоб-ной активностями обладали все использованные в работе культуры микромицетов. Следует отметить, что проявление активаторной к X фактору активности у протеаз микромицетов показано впервые.
Среди изученных штаммов культуры A. versicolor 1 и A. ustus 1 гидролизовали все использованные в работе хромогенные субстраты, что может указывать на широкую субстратную специфичность образуемых ими протеаз и отсутствие спе-
Таблица 1. Прямая и активаторная к белкам системы гемостаза активность внеклеточных протеаз аспергиллов
Субстрат* Плазма** Активность с хромогенными пептидными субстратами***, 10 3 ед. акт./мл
A. alliaceus 7dN1 A. nidulans 203 A. ochraceus L-1 A. sclerotio-rum 1 A. terreus 2 A. ustus 1 A. versicolor 1
Chromozym TH + 33.2 42.4 46.5 12.6 0 39.8 0 55.0 49.7
S-2238 + 0 22.9 3.3 0 0 0 0 5.7 17.8 0 18.2
S-2251 + 25.0 44.2 29.6 6.2 45.1 39.0 46.3
S-2765 + 0 24.4 0 0 0 34.6 0 0 0 38.9 37.5 42.2
S-2222 + 0 15.6 0 0 0 0 0 0 0 0 4.5 6.9
S-2366 + 0 28.4 0 4.8 0 65.9 0 0 0 64.3 24.3 40.5
S-2444 + 0 4.2 0 0 0 0 0 0 0 0 19.1 33.4
* СИготсвуш ТН и $-2238 — субстраты тромбина; S-2251 — субстрат плазмина; S-2765 и S-2222 — субстраты Ха фактора плазмы крови; $-2366 — субстрат активированного протеина С; $-2444 — субстрат урокиназы.
** Плазма "минус" — прямая активность с хромогенными субстратами; и плазма "плюс" — активаторная активность с хро-могенными субстратами. *** Прочерк — активность не определяли.
цифического воздействия на белки системы гемостаза.
Наибольшей активаторной активностью к протеину С обладала культура А. оскгасеш Ь-1 (65.9 х 10-3 ед. акт./мл), наибольшей активаторной к Х фактору — А. 1еггет 2 (38.9 х 10-3 ед. акт./мл). Следует отметить, что ни один из штаммов не проявлял какой-либо активаторной активности в отдельности, всегда проявлялось несколько таких активностей в отношении разных белков системы гемостаза. Так, культура А. аШасеш 7ё№ секрети-ровала протеазы с активаторной активностью к протеину С, протромбину и X фактору (табл. 1).
Следует отметить, что внеклеточные протеазы изученных микромицетов проявляли разную активность в отношении близких по строению субстратов. Так, протеолитические ферменты культур А. аШасеш 7ё№, А. тёШат 203, А. осктасеш Ь-1 и А. 1еггеш 2 оказались способны расщеплять субстрат тромбина — То8-01у-Рго-Лг§-рМЛ (СИгото2ут ТН), в то время как субстрат урокиназы 01р-01у-Лг§-рМЛ, не содержащий пролильного остатка между глицильным и аргинильным, гидролизо-вать не могли. Внеклеточные протеиназы А. аШасеш 7ё№, А. тёШат 203 и А. 1еггеш 2 не гидроли-зовали хромогенный субстрат активированного протеина С — 01р-Рго-Лг§-рМЛ, отличающегося от субстрата СИгото2ут ТН на 1 а.о. Это свойство было показано ранее для протеолитических ферментов микромицетов А. оскгасеш [6]. Протеина-
зы А. аШасеш 7ё№, А. оскгасеш Ь-1 и А. 1еггеш 2 также не были активными в отношении более специфического субстрата тромбина — Н-^-РИе-Р1р-Лг§-рМЛ ($-2238), что может указывать на важность геометрической структуры пептидного фрагмента для активного центра этих протеаз.
Активаторная активность протеаз аспергиллов в отношении сразу нескольких белков системы гемостаза может быть обусловлена как секрецией нескольких протеаз с разной специфичностью, так и образованием одного протеолитического фермента, обладающего способностью воздействовать на ряд проферментов, циркулирующих в кровотоке. Для проверки этого факта для дальнейшей работы были отобраны культуры А. оскга-сеш Ь-1 и А. 1еггеш 2.
Разделение полученных препаратов внеклеточных белков А. оскгасеш Ь-1 и А. 1еггеш 2 методом изоэлектрофокусирования показало, что протеолитическая активность в препаратах обеих культур аспергиллов представлена двумя пиками (рис. 3а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.