научная статья по теме ВОЗМОЖНОСТИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МОНОАМИНООКСИДАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МНОГОСТЕННЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ ГРАФИТОВЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИДЕПРЕССАНТОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ВОЗМОЖНОСТИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МОНОАМИНООКСИДАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МНОГОСТЕННЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ ГРАФИТОВЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИДЕПРЕССАНТОВ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 5, с. 470-475

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 543.866

ВОЗМОЖНОСТИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МОНОАМИНООКСИДАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МНОГОСТЕННЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ ГРАФИТОВЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИДЕПРЕССАНТОВ

© 2015 г. Э. П. Медянцева*, 1, Д. В. Брусницын*, Р. М. Варламова*, М. А. Бешевец*,

Г. К. Будников*, А. Н. Фаттахова**

*Химический институт им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета 1E-mail: Elvina.Medyantseva@kpfu.ru **Институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 Поступила в редакцию 23.01.2014 г., после доработки 14.04.2014 г.

Для определения антидепрессантов (имипрамин, афобазол, феназепам) предложены амперометри-ческие биосенсоры на основе планарных печатных графитовых электродов, модифицированных многостенными углеродными нанотрубками (МУНТ) и иммобилизованным ферментом моноами-нооксидазой (МАО). Функционирование предлагаемых биосенсоров основано на ингибирующей способности антидепрессантов. Сопоставлены аналитические возможности предлагаемых устройств c биосенсорами на основе электродов, не модифицированных МУНТ. Предложенные биосенсоры можно использовать для контроля как остаточных количеств лекарственных соединений в биологических жидкостях (урина), так и основного вещества в лекарственных формах2.

Ключевые слова: биосенсор, углеродные нанотрубки, антидепрессанты, моноаминооксидаза.

DOI: 10.7868/S0044450215050114

Для определения лекарственных препаратов в различных матрицах активно разрабатываются биосенсорные технологии [1—5], более быстрые и в ряде случаев менее трудоемкие, чем традиционные методы определения лекарственных препаратов (например, хроматографические).

Применение антидепрессантов (АД) для лечения депрессивных состояний человека и контроль за их использованием является сегодня одной из актуальных задач. Показано [6], что АД оказывают ингибирующее действие на моноами-нооксидазу (МАО). Примеры потенциометриче-ских [7] и амперометрических [8] моноаминоок-сидазных биосенсоров единичны.

Цель исследования заключалась в разработке новых амперометрических биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных многостенными углеродными нанотрубка-

2 Материалы статьи обсуждались на Втором Съезде аналитиков России, 23—27 сентября 2013 г., Москва.

ми и иммобилизованной моноаминооксидазой, для контроля содержания антидепрессантов в лекарственных препаратах и биологических жидкостях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве основы для биосенсора использовали планарные печатные графитовые электроды, описываемые как система "3 в 1" (изготовлены на кафедре аналитической химии КФУ), состоящие из рабочего (графитовые чернила фирмы Gwent Electronic Materials, США), вспомогательного электродов (графитовые чернила фирмы Gwent Electronic Materials, США) и электрода сравнения (паста Ag/AgCl), полученные на полимерной подложке методом трафаретной печати. Все измерения проводили с использованием потенциоста-та/гальваностата ^Autolab type III (Eco Chemie B.V., Нидерланды).

Фосфатные буферные растворы с рН 7.5 ± 0.2 готовили из препаратов квалификации ч. и ч. д. а.

(ЗАО "Лаверна", Россия). Использовали центрифугу СМ-50, Россия. Субстратами моноаминоок-сидазы служили дофамин (Дофамин-Ферейн, Россия — раствор для инъекций 4%-ный) и адреналин (эпинефрин) (Берингер Ингельхайм Фар-ма ГмбХ и Ко, Россия, 0.1%-ный раствор). Использовали имипрамин — ^(3-диметиламинопро-пил)иминодибензила гидрохлорид, афобазол — 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]бензимидазо-ла дигидрохлорид и феназепам — 7-бром-5-(2-хлор-фенил)-1,3-дигидро-1Н-1,4-бензодиазепин-2-он (Sigma-Aldrich, США), структурные формулы которых приведены ниже:

Использовали МАО, полученную из печени свиньи (гомогенат) с активностью 0.075 мкм/(мин мг) относительно дофамина.

Матричным материалом для иммобилизации фермента (МАО) на графитовые электроды, модифицированные МУНТ, служил бычий сывороточный альбумин (БСА) (Reanal, Венгрия). Применяли 12.5%-ный раствор глутарового альдегида (ГА) (ICN Biomedicals Ins., США).

Применяли многостенные углеродные нано-трубки с линейными размерами от 2—6 нм до 10— 15 нм производства Sigma-Aldrich. В качестве растворителей МУНТ использовали диметилформа-мид (ДМФА) [9] квалификации х. ч. и хитозан х. ч. в 0.5 %-ной СН3СООН [10]. Для получения дисперсий МУНТ в растворителях применяли ультразвуковую ванну (WiseClean, модель WUC— A03H, DAIHAN Scientific Co. Ltd, Корея), с частотой 40 КГц. Электроды, модифицированные МУНТ в хитозане или ДМФА, высушивали при комнатной температуре (20 ± 2°C) не менее суток.

Электрохимическую подготовку поверхности МУНТ проводили, регистрируя циклические вольтамперограммы в 0.5 М растворе Na2SO4 в те-

чение 10 мин в интервале потенциалов от 0 до 1.0 В при скорости развертки потенциала 100 мВ/с.

Получение биочувствительной части. Для получения биочувствительной части биосенсора на поверхность рабочего электрода (модифицированного или не модифицированного МУНТ) наносили смесь, содержащую раствор фермента, раствор БСА (50 мг/мл), фосфатный буферный раствор без солевого фона (50 мМ, рН 7.5) и 1%-ный водный раствор глутарового альдегида. После энергичного перемешивания на поверхность электродов наносили по 1 мкл этой смеси. Полученные таким образом биосенсоры оставляли на ночь в закрытой чашке Петри при +4°С. На следующий день биосенсоры промывали водой и после высушивания на воздухе хранили в холодильнике. Полученный биосенсор на основе МАО, хранящийся в холодильнике, сохранял каталитическую активность фермента в течение месяца с погрешностью не более 5—6%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моноаминоксидаза как фермент класса ами-нооксидаз [11] катализирует реакции окислительного дезаминирования моноаминов: серото-нина, дофамина, тирамина, а также адреналина, норадреналина. Продуктами реакций окислительного дезаминирования субстратов в присутствии МАО являются соответствующий альдегид, Н202 и NH3, уравнение (1). Предлагаемые моно-аминооксидазные биосенсоры (МАО-биосенсоры) основаны на сочетании реакции окислительного дезаминирования моноаминов и соответствующей реакции электроокисления одного из продуктов этой реакции, а именно Н202, уравнение (2).

МАО

Rj-CH2-NH-R2 + O2 + H2O

-- Rj-cC + R2-NH2 + H2O2.

H

(1)

Биохимическая реакция окислительного дез-аминирования моноаминов протекает по схеме (1),

HO

НО

Согласно данным [5], электрохимическое окисление Н202 протекает по следующей схеме:

Н2О2 = О2 + 2Н+ + 2е. (2)

Изучение электрохимического поведения дофамина и адреналина на графитовых печатных

472

МЕДЯНЦЕВА и др.

/*, % (б) (а)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Е, В

Вольтамперограммы, полученные на МАО-биосенсоре 3 типа: 1 — 0.07 М фосфатный буферный раствор (рН 7.5); 2 — фосфатный буферный раствор в присутствии 1 х 10 М адреналина и 1 х 10-6 М феназепама; 3 — то же в присутствии 1 х 10-7 М феназепама; 4 — в присутствии 1 х 10-4 М адреналина (а). Градуировочная зависимость для определения феназепама (МАО-биосенсор 3 типа, субстрат — 1 х 10-4 М адреналин) (б).

электродах, модифицированных МУНТ, показало, что на фоне фосфатного буферного раствора с рН 7.5 на циклических вольтамперограммах в интервале от 0 до 1 В наблюдается анодный пик (рисунок) окисления субстратов МАО. Пик окисления в интервале от 0.15 до 0.25 В связан с особенностями структуры данных соединений (возможность хи-нон-хиноидной перегруппировки).

Электрохимическое окисление адреналина протекает следующим образом:

НО НО

ОН

О.

О'

СН3

К'

ОН

Н

+ 2Н + 2е.

(3)

На МАО-биосенсоре при потенциалах 0.6— 0.7 В наблюдается дополнительный пик, соответствующий процессу окисления Н2О2, который согласно критерию Семерано (А1§ //А1§ V = 0.29, где I — ток, измеряемый при потенциале пика, мкА; V — скорость наложения потенциала, В/с) контролируется кинетикой электродного процесса.

При разработке амперометрических биосенсоров варьировали количество МУНТ, наносимое на рабочую поверхность электродов методом капельного испарения. Количество МУНТ на поверхности электрода изменяли от 2.5 до 0.5 мкл при концентрации исходного раствора 1 мг/мл в ДМФА или хитозане. Установлено, что макси-

мальная величина тока окисления Н202 наблюдается при концентрации МУНТ 1.0 мг/мл и количестве 1 мкл, т.е. содержание МУНТ составляло 0.014 мг/см2.

Для изучения действия АД на каталитическую активность МАО в составе биосенсоров использовали три типа биосенсоров: 1 тип — МАО-биосенсор на основе графитовых печатных электродов (немодифицированных); 2 тип — МАО-биосенсор на основе графитовых печатных электродов, модифицированных МУНТ в ДМФА; 3 тип - МАО-биосенсор на основе графитовых печатных электродов, модифицированных МУНТ в хитозане.

Определение эффекторов иммобилизованной

МАО. Показано [6, 12], что лекарственные соединения, относящиеся к классу АД, оказывают ин-гибирующее действие на каталитическую активность МАО. Изучение влияния исследуемых АД на каталитическую активность иммобилизованной МАО (ИМАО) показало, что ток окисления Н202 (0.65-0.7 В) в общем линейно зависит от концентрации в диапазоне от 1 х 10-4 (1 х 10-5) до (1 х 10-8) 1 х 10-9 М. При этом в присутствии АД аналитический сигнал уменьшается (рисунок), что указывает на их ингибирующее действие на каталитическую активность ИМАО. Поэтому в качестве аналитического сигнала использовали ток окисления Н202 как продукта окислительного

Таблица 1. Аналитические возможности различных типов МАО-биосенсоров для определения имипрамина (субстрат — адреналин, с5 = 1 х 10-3 М, п = 5, Р = 0.95)

Тип биосенсора Интервал концентраций, М Уравнение градуировочной зависимости I* = (A ± 5) + (B ± S)lgс Сн, М

(A ± 5) (B ± 5) r

1 1 х 10-8-1 х 10-4 (1.02 ± 0.04) (2.24 ± 0.06) 0.9814 6 х 10-9

2 1 х 10-8-1 х 10-5 (13.7 ± 0.9) (14.9 ± 0.9) 0.9869 1 х 10-9

3 1 х 10-9-1 х 10-4 (3.17 ± 0.09) (4.57 ± 0.01) 0.9901 4 х 10-10

I* = (71//о) х 100%, где II — величина аналитического сигнала (ток) в присутствии ингибитор

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком