УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2004, том 124, № 2, с. 123-143
УДК [616.1/.9-055.5/7-092]-085
ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ, ЕЕ МЕТОДЫ, ОБЪЕКТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
© 2004 г. М. С. Долгих
Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Москва
Исследуется современное состояние генной терапии (в том числе генно-клеточной терапии), ее место в науке и клинической практике, основные методы и мишени. Рассмотрены способы доставки генов в определенные органы и ткани ex vivo и in vivo, достоинства и недостатки основных вирусных векторов, а также возможности управления экспрессией введенных генов, пластичность стволовых клеток, возможности их дифференцировки. Проанализированы возможные пути улучшения выживаемости пересаженных клеток, несущих необходимый ген, а также основные генно-терапевтичес-кие подходы к лечению рака.
ВВЕДЕНИЕ
В 1990 г. была предпринята первая успешная попытка лечения методом генной терапии наследственного заболевания - недостаточности аденозиндезаминазы, приводящего к иммунодефициту. С этого момента генная терапия развивается чрезвычайно бурно [91]. За последнее десятилетие утверждено более 380 клинических протоколов, свыше 3 тыс. пациентов с различными патологиями (включая злокачественные новообразования (68%), моногенные наследственные (9.3%), инфекционные (13%) и другие заболевания) подверглись лечению методами генной терапии. По социальной значимости клинических протоколов генной терапии лидируют злокачественные новообразования, нейродегенеративные, кардиологические и наследственные заболевания. Одно из наиболее перспективных направлений -клеточная терапия с использованием клеток, модифицированных генно-инженерным способом, что, в частности, делает реальной пересадку трансгенных линий клеток в орган-мишень боль-ного[1, 2, 4, 7]. Когда будет полностью расшифрован геном человека, фармакология может пополниться 60-70 тыс. новых генно-инженерных препаратов. Ведущие фармацевтические фирмы вкладывают огромные средства в развитие генно-терапевтического направления. Более 396 проектов одобрены для клинических испытаний, из них 310 разрабатываются в США, и только 68 - в странах Западной Европы. Затраты американских фирм на развитие генной терапии в 1998 г. составили 250 млн долларов. Россия практически не участвует в этих исследованиях [1] .
Реально клинические протоколы используют при лечении тяжелых больных, для которых риск неудачи генной терапии меньше риска собственной болезни. Это больные раком, СПИДом, тяжелыми нейродегенеративными заболеваниями,
диабетом в тяжелой форме, атеросклерозом, смертельно опасными наследственными болезнями, такими как муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшена, дефицит аденозиндезаминазы и другие.
В настоящее время список болезней, которые пытаются лечить методами генной терапии, стремительно растет. В журнале Human Gene Therapy периодически приводятся клинические протоколы и сводные таблицы. На май 2002 года описано 505 случаев переноса генов, причем 319 из них приходится на генную терапию рака (из них 200 случаев - иммунотерапия рака in vivo и in vitro, 40 - введение тимидинкиназы вируса простого герпеса с последующей обработкой ганциклови-ром, 35 - трансфер гена-супрессора рака, 14 - введение гена, вызывающего лизис клеток и т.д.). В 55 случаях генная терапия применялась для лечения моногенных болезней, в 52 - генная терапия применялась для лечения различных болезней, таких как ревматоидный артрит, периферическая артериальная болезнь, артериальный рестеноз, коронарная артериальная болезнь, язва, болезни почек, нейродегенеративные заболевания и т.д. В 37 случаях генная терапия использовалась для лечения иммунодефицита человека и в 1 случае -вируса Эпштейн-Барра/цитомегаловируса [120] (табл. 1).
Основа генной терапии - так называемая позитивная генная терапия, базирующаяся на введении в клетки гена, кодирующего белковый продукт, необходимый для достижения лечебного эффекта. Негативная генная терапия предполагает подавление функций "больного" или избыточно экспрессирующегося гена с помощью введения специальных генетических конструкций.
Генетические конструкции можно вводить непосредственно в организм in vivo, а можно - в заранее извлеченные из организма его собственные
Таблица 1. Наследственные заболевания, генокоррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ) [2]
Болезнь Дефектный ген Клетки-мишени Стадия
Иммунодефицит Аденозиндезаминаза Лимфоциты КИ
Иммунодефицит Пуриннуклеозидфосфорилаза Лимфоциты ПВ
Семейная гиперхолестеринемия Рецептор липопротеинов низкой плотности Гепатоциты КИ
Гемофилия В Фактор IX Фибробласты КИ
Гемофилия А Фактор VIII Миобласты, фибробласты ЭР
Болезнь Гоше (сфинголипидоз) ß-глюкоцереброзидаза Макрофаги, стволовые клетки КИ
Болезнь Хантера Идуронатсульфатаза Макрофаги, стволовые клетки ПВ
Синдром Гурлера L-идуронидаза Макрофаги, стволовые клетки ПВ
Эмфизема легких a-1-антитрипсин Лимфоциты ЭР
Муковисцидоз CF-трансмембранный регулятор Эпителий бронхов КИ
Фенилкетонурия Фенилаланингидроксилаза Гепатоциты ЭР
Гипераммонемия Орнитинтранскарбамилаза Гепатоциты ПВ
Цитруллинемия Аргиносукцинатсинтетаза Гепатоциты ПВ
Мышечная дистрофия Дюшенна Дистрофин Миобласты, миофибриллы ЭР
Талассемия ß-глобин Эритробласты ЭР
Серповидноклеточная анемия ß-глобин Эритробласты ЭР
Респираторный дистресс-синдром Сурфактант белок В Эпителий бронхов КИ
Хронический гранулематоз NADPH-оксидаза Гранулоциты ЭР
Болезнь Альцгеймера Белок-предшественник ß-амилоида (ААР) нервные клетки ЭР
Болезнь Паркинсона Тирозингидроксилаза Миобласты, фибробласты, нервные клетки ЭР
Метахроматическая Арилсульфатаза А Стволовые клетки ПВ
лейкодистрофия крови,нервные клетки
Синдром Леш-Нихана Гипоксантинфосфорибозилтрансфераза Нервные клетки ПВ
или чужие культивируемые генно-модифициро-ванные клетки - ex vivo. В последнем случае можно говорить о генно-клеточной терапии. Если же в организм вводятся просто клетки, несущие здоровый естественный генетический набор, такая терапия называется клеточной. Современная генная терапия имеет дело главным образом с генной трансформацией соматических клеток. Если же происходит генетическое вмешательство в зародышевые клетки, можно говорить о трансгено-зе, который в настоящее время по отношению к человеку запрещен, однако, получает все большее распространение по отношению к животным. В 0.67% наблюдений получены успешные результаты [17, 18].
Предполагается использовать трансгенных животных не только для улучшения качества и количества продуктов питания, но и для синтеза in vivo лекарственных препаратов. В случае пере-
носа животным-донорам генов, кодирующих антигены основного комплекса гистосовместимос-ти реципиента, можно будет получать от таких животных в необходимом количестве органы и клетки для трансплантации человеку.
ОСНОВНЫЕ СРЕДСТВА ДОСТАВКИ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМ
Успехи генной терапии в полной мере зависят от успехов молекулярной биологии и, в частности, от развития средств доставки генов в организм, а также возможности управления их работой. В настоящее время применяются разные средства введения генов в клетки ex vivo и в организм in vivo. К ним относятся прежде всего конструкции наиболее разработанных вирусных векторов, при которых используются ретро-, адено-, лентивирусы, аденоассоциированные вирусы,
герпес-вирусы, вирусы гепатита В (для печени), гепаднавирусы, гемагглютинирующий японский вирус, а также искусственно создаваемые вирусы, которые сочетали бы желаемые качества. Помимо этого, используют различные липосо-мы, особенно катионные липосомы с образованием ДНК-липидных комплексов, комплексы ДНК с поликатионами, например, с полилизином, синтетические микросферы с плазмидной ДНК, метод трансфекции ДНК осаждением с фосфатом кальция, метод баллистической трансфекции плазмидной ДНК с частицами золота или вольфрама и метод электропорации, помогающий вводить ДНК в разной форме в клетку. Методы введения гена в клетки и организм рассматриваются во многих работах [2, 10,12, 29, 37, 42, 45, 51, 53, 71, 72, 73, 81, 94, 96, 106, 114, 137]. В настоящее время активно ведутся работы по созданию вектора, приближающегося по качествам к хромосоме человека. Очевидно, что такой вектор должен иметь для нормальной работы регион начала реп-ликации-ori, центромеру и теломерные последовательности.
При конструировании вирусного вектора из вирусного генома вырезают гены, существенные для репликации патогенного вируса и заменяют их генами, которые необходимо доставить в клетки. Такой неполноценный и непатогенный вирус, несущий требуемый ген, размножают в специальных паковочных линиях клеток и затем вводят в клетки ex vivo или прямо в кровоток или в орган in vivo [54].
Все эти методы и вектора имеют свои преимущества и недостатки, которые следует учитывать в каждом конкретном случае. Например, ретро-вирусы способны обеспечить стабильную экспрессию гена, но имеют ограниченную емкость для внедрения трансгена, встраиваются в геном только делящихся клеток и их трудно получить в высоких титрах. Кроме того, ретровирусы представляют определенную опасность, поскольку в результате случайной рекомбинации дефектного векторного ретровируса с остатками предсущест-вующих ретровирусных элементов в пакующей линии или, что менее вероятно, в геноме человека может возникнуть инфекционный вирус, приводящий к возникновению рака. Аденовирусы имеют большой размер генома, могут быть получены в высоких титрах и имеют тропность к широкому спектру тканей, однако, они не встраиваются в геном, а существуют в клетке в виде эпи-сомы, и поэтому не могут обеспечить стабильную экспрессию встроенных генов. Кроме того, аденовирусы вызывают серьезный иммунный ответ хозяина и реакцию воспаления. Несмотря на это, они остаются перспективной базой для создания векторов нового поколения [22, 46, 73].
Помимо указанных в табл.2, используются также лентивирусы (HIV), которые дают стабильную экспрессию и инфицируют неделящиеся клетки [9, 48, 53], а также Baculovirus [103]. Возможно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.