ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 2, с. 291-300
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.174.1/2:582.263:577.344
ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ НЕДЕСТРУКТИВНОГО ОПТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА КУЛЬТУР ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ПРИ СБАЛАНСИРОВАННОМ РОСТЕ1 © 2015 г. К. А. Чеканов*, А. Е. Соловченко***
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 13.05.2014 г.
Для исследования физиологического состояния и кинетики роста суспензионных культур одноклеточных водорослей важно оперативное получение информации о ключевых параметрах, таких как накопление сухого веса, число клеток и содержание в них пигментов (хлорофиллов и каротинои-дов). Показана возможность недеструктивного определения этих параметров по спектрам оптической плотности (ослабления света вследствие его поглощения пигментами и рассеяния света содержащими их клетками) суспензий одноклеточных зеленых водорослей ЕиНа еагойпоза Кошагек и НаетШвсосетр1ыу1аШ Flotow (СЫогорЬусеае). Установлено, что для надежного определения содержания пигментов у морфологически гетерогенных культур, таких как Н. р1ыу1аШ, необходима компенсация вклада светорассеяния в измеренную величину оптической плотности. С другой стороны, использование сигнала светорассеяния у культур с низкой морфологической гетерогенностью применимо для оценки накопления сухого веса и числа клеток. Определены спектральные области, чувствительные к различным параметрам культуры, созданы линейные алгоритмы для расчета искомых параметров. Обсуждаются возможности и ограничения применимости оптического недеструктивного мониторинга состояния культур в условиях сбалансированного роста, а также потенциал разработанного подхода для биотехнологии микроводорослей.
Ключевые слова: Наета(ососсы$ р1ыу1аН$ — ЕШа сагоНпо5а — оптическая плотность — светорассеяние — коэффициент корреляции
DOI: 10.7868/S0015330315010030
ВВЕДЕНИЕ
Культура одноклеточных водорослей (микроводорослей, МВ) является распространенной модельной системой в физиологии, биохимии и молекулярной биологии фотоавтотрофных организмов, а также важным объектом биотехнологии [1, 2]. Для рутинного наблюдения за ростом и физиологическим состоянием культур, как пра-
1 Представлено на Международной конференции "Физиология и биотехнология оксигенных фототрофных микроорганизмов: взгляд в будущее" (27-30 мая 2014 г.).
Сокращения: Кар — каротиноид(ы); МВ — микроводоросли; ОП — оптическая плотность; СВ — сухой вес; Хл — хлоро-филл(ы); ОТИ — ближняя ИК-область; КМ^Е — среднеквадратичная ошибка определения.
Адрес для корреспонденции: Соловченко Алексей Евгеньевич. 119234 Москва ГСП-1, Ленинские горы, 1, корп. 12. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биоинженерии. Факс 007 (495) 939-38-07; электронная почта: solovchenko@mail.bio.msu.ru
вило, применяют ручной, реже автоматизированный подсчет клеток, гравиметрическое определение сухого веса, а для регистрации изменений пигментного состава - экстракцию неполярными растворителями с последующим спектрофото-метрическим или хроматографическим анализом [3]. Эти методы трудоемки, отнимают много времени и подвержены ошибкам, автоматизированные же разновидности таких методов требуют дорогостоящего оборудования (проточные цито-флуориметры, счетчики Култера, системы обработки изображений и т.д.).
В связи с этим практикуются методы, основанные на измерении оптической плотности (ОП) суспензий без разрушения клеток. В частности, показана применимость оптических методов для оценки стрессовых реакций пигментного и липидного метаболизма МВ, таких как Heamato-coccus pluvialis (Chlorophyceae) [4], Parietochloris incisa (Trebouxiophyceae) [5] и Nannochloropsis oceanica (Eustigmatophyceae) [6]. Однако использова-
ние этих методов также сопряжено с трудностями из-за сложности оптических свойств клеточных суспензий и несовершенства спектрофотометри-ческой техники. В частности, спектры суспензий клеток МВ характеризуются значительными искажениями вследствие высокого и, как правило, неопределенного вклада светорассеяния в результате частичного преломления луча на поверхности клеток и внутриклеточных структур, а также специфической упаковки пигментов [7-13]. Как следствие количественные расчеты на основании ОП клеточных суспензий не отличаются высокой точностью, а спектры суспензий, записанные на разных приборах, невозможно сравнивать напрямую.
Для снижения влияния светорассеяния на спектры предлагались различные подходы, основанные на получении спектров обесцвеченных клеток с последующим вычитанием его из спектра оптической плотности суспензии, гомогенизации, анализа оптических свойств каждой отдельной клетки и использовании интегрирующих сфер (сфер Ульбрихта) [8, 9, 13, 14]. Также рассеянный свет несет ценную информацию о суспензии МВ, связанную с числом, размерами и формой клеток. Таким образом, для оптического мониторинга состояния суспензий МВ необходим метод, учитывающий поглощение и рассеяние света образцом и обладающий при этом высокой чувствительностью и точностью.
Весьма эффективным в отношении многих видов МВ оказался подход к компенсации вклада светорассеяния в спектры ОП клеточных суспензий, разработанный в нашей лаборатории Мерзляком с соавт. [13, 14]. Он основан на допущении, что оптическая плотность суспензии (-О(Х)) может быть приближенно представлена как сумма независимых друг от друга вкладов светопогло-щения и светорассеяния:
ДХ) ~ А (X) + ВД,
где А (X) - вклад светопоглощения, Б(Х) - вклад светорассеяния при длине волны X [8, 14]. Данное выражение для оптической плотности можно получить при допущениях, что частиц в суспензии не слишком много (т.е. они поглощают свет независимо друг от друга), все они имеют форму куба одинакового объема, а интенсивность поглощенного и рассеянного каждой отдельной клеткой света не слишком велика [8].
Применение такого подхода позволяет разделять и анализировать по отдельности вклады поглощения света пигментами и светорассеяния в общее ослабление света суспензией клеток. Однако до настоящего времени этот подход не применялся для количественного недеструктивного анализа содержания пигментов и иных параметров культур МВ. В настоящей работе предприня-
та попытка разделения вкладов поглощения света и светорассеяния и использования этого подхода в сочетании с методологией анализа пигментов по оптическим спектрам, ранее разработанной и успешно примененной Гительсоном и Мерзляком [15, 16] при работе с листьями и плодами высших растений.
Согласно этой методологии, исследование связи спектров поглощения суспензий с основными параметрами культур включало три этапа: получение массива данных, содержащего спектры и соответствующие им параметры культуры; поиск спектральных индексов, чувствительных к искомым параметрам; выбор модели (функции, связывающей спектральные индексы поглощения суспензий с содержанием в ней каротино-идов и хлорофиллов, сухим весом и числом клеток), а также проверку (валидацию) разработанного алгоритма на независимо полученном массиве данных.
Объектами исследования служили МВ ЕМ1а carotinosa [17] и Наета1ососсы8р1иу1а11$ [18]. Интерес к этим видам обусловлен их способностью накапливать при действии стрессоров высокие количества ценного кетокаротиноида астаксанти-на, широко применяемого при производстве косметических и лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок [18]. В результате была показана возможность количественного определения содержания суммы хлорофиллов (Хл), отношения Хл и каротиноидов (Кар) в клетках, а также (для Е. сагоШоза) сухого веса (СВ) и числа клеток (N0 в единице объема суспензии на всех фазах сбалансированного роста культуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изолят каротиногенных МВ, идентифицированных как Haematococcuspluvialis Flotow (Генбанк, ГО JQ867352), выделен Е.С. Лобаковой (МГУ им. М.В. Ломоносова) в супралиторальной зоне бассейновой части Белого моря (66°29'48" в.д., 33°24'22" с.ш.). Культура ЕпНа carotinosa MAINX была предоставлена сотрудниками Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Национальной академии наук Украины.
Клетки МВ культивировали в фотобиореакто-рах закрытого типа в 0.6-литровых стеклянных колоннах диаметром 40 мм в 400 мл среды BG-11 [19] при постоянной температуре (27°С), интенсивности света 40 мкЕ ФАР/(м2 с) и продувании атмосферным воздухом (400 мл/мин).
Пигменты экстрагировали из клеток МВ диме-тилсульфоксидом (ДМСО). Аликвоту суспензии центрифугировали в течение 5 мин при 3000 g, су-пернатант удаляли, клеточный осадок ресуспен-дировали в ДМСО, затем инкубировали 5 мин при 70° О и интенсивном встряхивании. На ста-
ционарной фазе роста (12-14 суток культивирования) клетки обладали более плотной стенкой, поэтому для обеспечения полноты экстракции длительность инкубации в ДМСО увеличивали до 15 мин, экстракцию повторяли дважды и экстракты объединяли. Концентрацию Хл a и b, а также суммы Кар в экстракте определяли спек-трофотометрически [5]. Сухой вес определяли весовым методом [20], подсчет клеток производили в камере Горяева.
Спектры поглощения в диапазоне 400-800 нм снимали в 1-сантиметровых кварцевых кюветах на спектрофотометре Agilent Cary 300 ("Agilent", США), оснащенном 150-миллиметровой интегрирующей сферой CA-30I того же производителя, и корректировали на рассеяние, как описано в работе [13]. Для предотвращения оседания в процессе развертки спектра клетки непосредственно перед снятием спектра переносили из среды культивирования в смесь глицерина с водой (1 : 1, по объему).
На всех стадиях роста состояние культур МВ контролировали методом световой микроскопии с использованием моторизованного цифрового фотомикроскопа Eclipse 90i ("Nikon", Япония).
Все измерения проводили в трех аналитических проворностях, на рисунках представлены усредненные данные. Для измерений отбирали пробы (n = 10) на различных этапах роста культуры (проведено не менее трех независимых экспериментов для к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.