научная статья по теме ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИКО-ЛАЗЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ Математика

Текст научной статьи на тему «ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИКО-ЛАЗЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 429, № 4, с. 550-553

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 576.341:591.391

возможности оптико-лазерных технологии в клеточной инженерии

© 2009 г. А. К. Шахбазян, А. К. Карменян, Т. А. Свиридова-Чайлахян,

А. С. Кривохарченко, А. Чои, член-корреспондент РАН Л. М. Чайлахян

Представлено академиком Л.А. Пирузяном 15.05.2009 г. Поступило 18.05.2009 г.

Для повышения эффективности клонирования млекопитающих требуется усовершенствование существующих приемов и методов с целью последующего их широкого использования на практике. Хотя все процедуры по клонированию общеизвестны, они остаются плохо воспроизводимыми и для их проведения необходима высокая квалификация персонала. Практикуемые сейчас приемы пересадки ядер могут сами по себе существенно влиять на клетки и соответственно являться одной из причин низкой степени выживания и развития клонированных организмов [1—8].

Реконструкция эмбрионов млекопитающих представляет собой ряд достаточно сложных микрохирургических манипуляций, которые проводятся поэтапно. Первоначально подготавливают реципиентный цитопласт путем удаления или инактивации собственного генома клетки-реципиента (ооцита или зиготы). После этого этапа следует процедура, связанная с введением карио-пласта или целой соматической клетки с помощью микроинструментов под блестящую оболочку (zona pellucida) цитопласта, и эта процедура наименее травматична для оперируемых клеток. Третий этап связан с электростимулируемым слиянием кариопласта и цитопласта. При электрослиянии применяют специальные диэлектрические среды с экстремально низкими концентрациями жизненно важных ионов, что может неблагоприятно влиять на последующее развитие эмбрионов [9]. Даже если электрослияние проводится в обычных средах [1, 10], оно все равно вызывает значительные изменения внутриклеточного ионного гомеостаза у реконструированных

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук, Пущино Московской обл.

Институт биофотоники Ян-Мин университета, Тайпей, Тайвань

Макс-Дельбрук Центр молекулярной медицины, Берлин, Германия

зародышей [11, 12] вследствие электропробоя и вероятного формирования временных пор по всей поверхностной мембране, а не только в области контакта клеток [13, 14]. Таким образом, электрослияние также может приводить к значительному снижению жизнеспособности реконструированных эмбрионов.

В настоящей работе впервые использовали лазер для всех выше перечисленных этапов по клонированию млекопитающих, заменив им как механические микроманипуляции, так и микрохирургический инструментарий. Все ключевые операции: энуклеацию, перенос соматической клетки (кариопласта) под оболочку цитопласта и ее плотное сближение с реципиентным цитопла-стом, слияние цитопласта и соматической клетки осуществляли неинвазивно, только с помощью оптико-лазерных манипуляций.

В экспериментах были использованы самки мышей C57BL/6 в возрасте 1.5—2.5 мес, которых суперовулировали по стандартной методике. Для суперовуляции использовали гормоны PMSG (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, "Sigma") и hCG (человеческий хорионический гонадотропин, "Sigma"). Ооциты выделяли из яйцеводов через 15—17 ч после введения hCG в культу-ральной среде М2 ("Sigma"), содержащей 0.1% гиалуронидазы ("Sigma") для освобождения от кумулюса. Клетки кумулюса собирали и использовали затем в качестве доноров ядер. Для парте-ногенетической активации ооциты промывали в среде М16 ("Sigma") и сразу обрабатывали стронцием (2 мМ Sr2+ в среде М16) [15] в течение 30 мин. Затем тщательно промывали и культивировали in vitro в 4-луночных пластиковых чашках "Nunclon" ("Nunc™" Gibco Europe Ltd) в среде М16 в инкубаторе "REVCO Elite II" (США) при температуре 37°С и 5% СО2 в воздухе в течение 6 ч. После этого отбирали для экспериментов ооциты с четко видимым пронуклеусом. Для проведения всех операций использовали инвертированный микроскоп "Olympus IX71" (Япония), со-

ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИКО-ЛАЗЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

551

©

(a) ,

Рис. 1. Энуклеация ооцита и перфорирование блестящей оболочки. а — активированный ооцит на стадии пронуклеуса; б — энуклеация ооцита лазерным облучением пронуклеуса (указано стрелкой); в — перфорирование блестящей оболочки энуклеированного ооцита (указано стрелкой).

пряженный с лазером Tsunami ("Spectra Physics", США) и полупроводниковым лазерным модулем. Лазер Tsunami работал в пикосекундном режиме с частотой повторения 80 МГц на длине волны 800 нм, среднюю мощность излучения меняли в пределах от 0.08 до 0.8 Вт. Этот лазер использовали для энуклеации ооцитов, захвата и переноса соматических клеток, а также для их слияния с ооцита-ми. Лазерный модуль работал на длине волны 1448 нм со средней мощностью до 400 мВт и использовался для перфорирования блестящей обо-

Рис. 2. Перенос соматической клетки под блестящую оболочку ооцита. а — лазерный захват кумулюсной клетки; б — лазерное перемещение клетки кумулюса к отверстию в блестящей оболочке ооцита; в — лазерный перенос клетки кумулюса непосредственно через отверстие в блестящей оболочке; г — клетка кумулюса в перивителлиновом пространстве ооцита. (Стрелки на рисунке указывают на клетку кумулюса).

552

ШАХБАЗЯН и др.

(a)

(б)

(в)

Рис. 3. Слияние ооцита с редукционным тельцем и с соматической клеткой. а — ооцит с редукционным тельцем; б — лазерное облучение области контакта ооцита с редукционным тельцем (указано стрелкой); в — процесс слияния ооцита с редукционным тельцем (указано стрелкой); г — клетка кумулюса в плотном контакте с ооцитом (указано стрелкой); д — лазерное облучение области контакта ооцита и клетки кумулюса (указано стрелкой); е — ооцит, слившийся с клеткой кумулюса.

лочки ооцитов. Параметры применяемого лазерного модуля были идентичны параметрам лазерной системы Zilos, стандартно используемой в медицинских репродуктологических клиниках для перфорирования блестящей оболочки ооцитов человека. Все операции проводили в специальной экспериментальной камере из двух покровных стекол в среде М2.

Было проведено три серии экспериментов: 1) лазерная энуклеация ооцитов и затем лазерное перфорирование блестящей оболочки; 2) лазерный захват и перенос соматических (кумулюс-ных) клеток под блестящую оболочку; 3) лазерное слияние ооцитов и соматических клеток. В пер-

вой серии экспериментов для проведения операции 5—10 ооцитов помещали в экспериментальную камеру, затем на экран монитора выводили один ооцит (рис. 1а) и как первый этап проводили его энуклеацию лазером Tsunami (рис. 1б). Для энуклеации ооцита было достаточно однократного облучения пронуклеуса импульсом мощностью 0.1—0.3 Вт и длительностью 0.3 с, сфокусированным на одно из проядрышек. После энуклеации использовали полупроводниковый лазерный модуль для пробоя блестящей оболочки. Участок для перфорирования оболочки подбирали таким образом, чтобы при пробое не повредить цитопласт, затем лазером проводили его облучение (давали им-

ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИКО-ЛАЗЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

553

пульс) мощностью 240—300 мВт и длительностью 800—1000 мкс (рис. 1в). Диаметр полученного отверстия составлял 12—15 мкм.

В следующей серии экспериментов проводили лазерный захват и перемещение клеток кумулюса диаметром 7—9 мкм под блестящую оболочку. Операцию по захвату и перемещению соматических клеток проводили с помощью лазера Tsunami при непрерывном режиме излучения и мощностях в пределах до 20—30 мВт (рис. 2). Весь этап в целом с операциями по нахождению, захвату и перемещению клетки кумулюса под блестящую оболочку ооцита занимал 1—3 мин. При этом в отличие от общепринятой микрохирургической процедуры не требовалось фиксации ооцита специальным инструментом — микроприсоской.

В последней серии экспериментов изучали возможность слияния с помощью лазера клеток, которые значительно отличаются по объему и соответственно имеют небольшую область контакта между ними. Сначала опыты по лазерному слиянию проводили на модельной системе: пробовали сливать ооцит с редукционным тельцем (близким по размеру к соматической клетке), имеющим естественный плотный контакт с мембраной ооцита. В экспериментах было использовано 53 ооцита. После лазерного облучения (0.02 с) области контакта ооцита и редукционного тельца слияние наблюдали у 24 ооцитов (рис. 3а—в). Таким образом, эффективность лазерного слияния составила 45.3%, при этом все слившиеся с редукционным тельцем ооциты имели нормальную морфологию без каких-либо признаков разрушения. Вслед за этим проводили лазерное слияние соматической клетки с ооцитом (рис. 3г—е). Клетку кумулюса, введенную под блестящую оболочку с помощью лазерного захвата, по возможности плотно прижимали к ооциту (рис. 3г) и достигали тем самым необходимого для слияния контакта ооцита и соматической клетки. Далее лазерным импульсом с вышеуказанными параметрами облучали визуально отобранную точку на линии наиболее плотного контакта (рис. 3д). В результате вскоре наблюдали слияние ооцита и клетки кумулюса (рис. 3е). Как известно, при электрослиянии (вследствие электропробоя мембран) определенный процент слившихся клеток может погибать в течение последующих 2—3 ч культивирования in vitro. В наших экспериментах по лазерному слиянию при культивировании in vitro слившихся ооцитов в течение 2—3 ч никаких разрушений не наблюдалось.

Проведенные исследования показали, что использование лазера вместо традиционных методов клеточной инженерии для ключевых этапов клонирования может иметь ряд преимуществ. В первую очередь при оптико-лазерной микрохирургии эмбрионов нет необходимости использовать какие-либо стеклянные микроинструменты

и механические микроманипуляторы. Инвазив-ный характер вмешательства в клетку стеклянными инструментами неминуемо приводит к серьезным травмам оперируемой клетки и соответственно к низкому конечному результату. Кроме того, слияние лазером в отличие от электрослияния не требует смены операционных камер, применения специальных сред и проводится в стандартной среде М2 для манипуляций с зародышами. Определенно можно сказать, что при слиянии лазером луч действует на мембраны в области контакта клеток в узкой области

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»