СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2008, том 22, № 3, с. 257-270
= НОЦИЦЕПЦИЯ
УДК 612.822.3
ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ КОДИРОВАНИЯ
НОЦИЦЕПТИВНЫХ СИГНАЛОВ: РОЛЬ МЕДЛЕННЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ
© 2008 г. Е. Ä. Карымова, И. Е. Катина1, В. Б. Плахова, С. Ä. Подзорова, М. Ä. Кулов2, В. К. Иванов2, Б. В. Крылов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6 E-mail: krylov@infran.ru 1 Институт физиологии им. А.А. Ухтомского СПбГУ 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9 2 Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет 194021 Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 29 Поступила в редакцию 18.12.2007 г.
Разработана математическая модель Ходжкина-Хаксли мембраны ноцицептивного нейрона, отличительной особенностью которой является участие медленных натриевых каналов (каналов Nayl.8) в кодировании болевого сигнала. Характеристики этих каналов были получены экспериментально с помощью метода локальной фиксации потенциала. В качестве экспериментального агента, специфически модулирующего воротные характеристики медленных натриевых каналов, была использована коменовая кислота. Исследования на модели показали, что уменьшение вклада медленных натриевых каналов в процессе генерации повторных ответов при постоянном стимулирующем токе снижает их частоту. Это обусловлено двумя факторами, обнаруженными экспериментально. Первый фактор - уменьшение эффективного воротного заряда медленных натриевых каналов, второй -смещение зависимости натриевой проводимости от потенциала в деполяризационном направлении. Расчеты на модели показали, что каждый из этих факторов снижает частоту импульсной активности ноцицептивного нейрона и, следовательно, ведет к уменьшению болевого сигнала, сохраняя при этом способность нейрона генерировать сигналы других модальностей. Полученные данные позволяют предсказать возможное применение коменовой кислоты в качестве лекарственной субстанции при создании высокоэффективного неопиоидного анальгетика.
Ключевые слова: медленные натриевые каналы (каналы Nav1.8), коменовая кислота, ноцицептив-ный нейрон, метод локальной фиксации потенциала, модель Ходжкина-Хаксли, анальгезия.
ВВЕДЕНИЕ
Первая стадия формирования болевого ощущения связана с активацией тканевых периферических рецепторов, так называемых ноцицепто-ров, способных кодировать информацию не только о болевом, как правило, повреждающем воздействии, но и о сигналах других модальностей. Ноцицептивные сигналы передаются по афферентным волокнам группы С, а также по самым тонким из миелинизированных волокон -волокнам группы А§. Слабые механические и температурные стимулы считаются адекватными для ряда кожных рецепторов. Сигналы этих модальностей преобразовываются рецепторной мембраной в аналоговый сигнал - рецепторный ток, а затем электровозбудимой мембраной - в универсальный для нервной системы дискретный код нервных импульсов. Низкая частота нервных импульсов несет информацию об адекватном, на-
пример, тактильном (механическом) воздействии, а ее повышение при резком усилении воздействия является сигналом о возможном повреждении. Именно эта более высокочастотная посылка нервных импульсов и воспринимается нами как болевое ощущение. Частотная граница, отделяющая ноцицептивные разряды от субноцицептив-ных, может быть очень низкой, составляя примерно 2 Гц. Так, для кожных рецепторов кошки показано, что в С-волоконах диапазон частоты импульсации болевого сигнала составляет 220 Гц (ВогоуИдауа й а1., 1997; Яеуепко й а1., 2000). Процесс аналого-импульсного преобразования, осуществляемый ноцицептивной мембраной, является базисным механизмом кодирования болевого ощущения. При этом центральной молекулярной структурой, определяющей частоту повторных ответов, служат потенциалозависимые натриевые каналы.
Известно, что окончательное формирование ноцицептивного сигнала происходит на уровне дорзальных корешков спинного мозга (Bischoff, Kochs, 1993; Ogata, Ohishi, 2002; Diss et al., 2004) и определяется свойствами и функциональным состоянием сомы сенсорных нейронов спинальных ганглиев. При механических повреждениях или действии гипералгезических агентов происходит изменение уровня экспрессии различных изо-форм натриевых каналов (Akopian et al., 1996; Gold et al., 1996; Waxman, 1999; Ogata, Ohishi, 2002; Abdula, Smith, 2001; Lai et al., 2004). В результате этого нейроны могут стать гипервозбудимыми, способными к генерации спонтанной активности, которая лежит в основе воспалительной и нейро-патической боли (Ogata, Ohishi, 2002; Diss et al., 2004).
В ноцицептивных нейронах особая роль в формировании импульсной активности принадлежит медленным тетродотоксин-устойчивым (TTXr) натриевым каналам (Kostyuk et al., 1981; Gold et al., 1996). По международной классификации каналы данного типа обозначаются как Na^.8 (Goldin, 2001). Именно эти каналы определяют также характер разрядов С-афферентов, который воспринимается в качестве болевого (Brock et al., 1998; Strassman, Raymond, 1999; Borovikova et al., 1997; Revenko et al., 2000).
Показано, что при всех воздействиях, вызывающих сильную длительную боль (воспалительную, нейропатическую), происходит увеличение плотности или уровня активности данной популяция каналов в мембране сенсорного нейрона (Akopian et al., 1996; Gold et al., 1996; Waxman et al., 1999; Lai et al., 2000; Abdula, Smith, 2001; Malik-Hall et al., 2003; Lai et al., 2004). Напротив, анальгезиру-ющие агенты, независимо от первичной мишени воздействия, должны избирательно снижать функциональную активность медленных натриевых каналов (Brau et al., 2001; Ogata, Ohisi, 2002). В настоящее время наиболее эффективными анальгетиками являются опиоидные препараты, такие как, например, морфингидрохлорид. Однако их действие не является избирательным и сопряжено с рядом негативных побочных эффектов.
Ранее нами был обнаружен механизм воздействия на медленные натриевые каналы, опосредованный изменением их потенциалочувствительно-сти (Крылов и др., 1999; Derbenev et al., 2000; Krylov, Shchegolev, 2006). При активации связанных с ними опиоидоподобных рецепторов происходит снижение потенциалочувствительности, обусловленное двумя факторами. Первый фактор - это снижение потенциалочувствительности активационно-го воротного устройства этих каналов, что является следствием уменьшения величины эффективного воротного заряда. Второй фактор - сдвиг активационной кривой медленных натриевых ка-
налов в сторону более положительных потенциалов. Очевидно, что оба указанных фактора должны уменьшать вклад медленных каналов в процесс кодирования импульсной активности ноцицептора, что в свою очередь может вызывать снижение частоты повторных ответов электровозбудимой мембраны ноцицептивного нейрона, и, в конечном итоге, приводить к купированию болевого сигнала.
Перспективным, с нашей точки зрения, направлением исследований в области ноцицепции стал поиск субстанций неопиоидной природы, способных специфически модулировать воротные характеристики медленных натриевых каналов. Наиболее эффективным агентом для решения этой задачи является коменовая кислота - одно из производных гамма-пирона (5-гидрокси-у-пирон-2-карбоновая кислота).
Цель данной работы - исследование роли медленных натриевых каналов в кодировании ноцицептивного сигнала.
Метод математического моделирования позволяет выяснить специфическую роль каждого из указанных выше факторов (уменьшение эффективного заряда и сдвига активационной кривой). В нашей работе мы применили его в комплексе с методом локальной фиксации потенциала, с помощью которого получены экспериментальные данные, позволившие установить основные кинетические и стационарные характеристики медленных натриевых каналов для построения модифицированной модели Ходжкина-Хаксли (Hodgkin, Huxley, 1952d). В качестве модулирующего агента была выбрана коменовая кислота.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод локальной фиксации потенциала
Культура диссоциированных нейронов. Эксперименты выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс линии Wistar. Для выделения нейронов был использован модифицированный метод краткосрочного культивирования (Elliott, Elliott, 1993), обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток.
Новорожденных крысят, вес которых не превышал 10 г, наркотизировали нембуталом (50 мг/кг, внутрибрюшинно). Дорсальные ганглии выделяли из областей L5 - S1 спинного мозга и помещали в раствор, состоящий из смеси среды Игла и раствора Хэнкса (1:1). В качестве буфера ионов водорода использовали HEPES-Na в концентрации 10 мМоль (pH 7.4). Ферментативную обработку (Kostyuk et al., 1981) проводили в течение 1215 мин при температуре 34-37°С в растворе, содержащем 2 мг/мл коллагеназы (тип 1А), 1 мг/мл
проназы-Е ("Sigma"). Затем ганглии тщательно отмывали путем центрифугирования (1 мин, 900 об/мин) и последующей сменой надосадочной жидкости. Для отмывки и культивирования использовали среду на основе среды Игла (MEM) с добавлением глютамина (2 ммоль/л), эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (10%), глюкозы (0.6%), гентамицина 40 ед/мл. Механическую диссоциацию проводили путем пипетирования. Клетки ненейронального происхождения (шванновские клетки, фибробласты) отделяли при помощи осаждения на пластиковой поверхности чашки Петри в течение 25 мин. Далее обогащенную суспензию клеток культивировали на покрытой коллагеном поверхности чашек Петри (16 мм) при 37°С. Регистрацию электрической активности нейронов начинали спустя 1-2 ч после завершения культивирования. Клетки сохраняли жизнеспособность и были использованы в опытах в течение одних суток. Использованная методика выделения была описана ранее (Плахова и др., 2000).
Использованные растворы и химические препараты. Для экспериментов в режиме фиксации потенциала использовали следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л).
Внеклеточный раствор: NaCl - 65, CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, холин-хлорид - 70, HEPES-Na - 10, TTX (тетродотоксин) - 0.0001, pH 7.4.
Внутриклеточный раствор: CsF - 100, NaCl -10, CsCl - 40, MgCl2 - 2, HEPES-Na - 10, pH 7.2.
Исключение и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.