СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2011, том 25, № 4, с. 329-339
СОМАТОСЕНСОРНАЯ СИСТЕМА
УДК 612.822.3
ВОЗМОЖНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ со2-лазера с мембраной
СЕНСОРНОГО НЕЙРОНА
© 2011 г. И. Л. Ячнев, С. А. Подзорова, В. Б. Плахова, И. В. Рогачевский,
Б. В. Крылов
Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д.6 E-mail: krylov@infran.ru
Поступила в редакцию 24.01.2011 г.
Методом локальной фиксации потенциала исследовано взаимодействие низкоинтенсивного излучения СО2-лазера с мембраной культивируемых диссоциированных ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев крысы. Установлено, что низкоинтенсивное инфракрасное (ИК) излучение уменьшает потенциалочувствительность активационного воротного устройства медленных натриевых каналов (Nav1.8), причем уабаин, блокатор как насосной, так и трансдукторной функций №+,К+-АТФазы, устраняет действие излучения. Рассмотрен молекулярный механизм взаимодействия излучения СО2-лазера с мембраной этого сенсорного нейрона, первичным актом которого является процесс поглощения энергии ИК-излучения молекулами АТФ. Взаимодействие колебательно-возбужденных молекул АТФ с №+,К+-АТФазой, сопровождаемое передачей энергии излучения в форме колебательной энергии от молекул АТФ молекулам №+,К+-АТФазы, приводит к активации трансдукторной функции №+,К+-АТФазы, что в свою очередь является причиной снижения потенциалочувствительности медленных натриевых каналов. Этот механизм, отличающийся высочайшей чувствительностью, позволяет объяснить нетепловое взаимодействие низкоинтенсивного ИК-излучения с мембраной сенсорного нейрона.
Ключевые слова: инфракрасное излучение, натриевые Nav1.8 каналы, №+,К+-АТФаза, ноцицептив-ные нейроны, колебательное возбуждение, метод локальной фиксации потенциала.
ВВЕДЕНИЕ
Использование СО2-лазера для исследования механизмов рецепции ИК-излучения имеет сорокалетнюю историю. При воздействии излучения этого лазера, имеющего длину волны 10.6 мкм, на ямковый орган удава Boa constrictor в качестве ответной реакции наблюдалось изменение электроэнцефалограммы исследуемого животного в области плотностей энергии излучения (6.2711.29) • 10-5 Дж/см2 (Harris, Gamov, 1971). В более поздней работе, посвященной изучению ямкового органа гремучей змеи Agkistrodon contortrix, исследовалось изменение импульсной активности афферентов тройничного нерва. В этом случае пороговая плотность энергии излучения СО2-ла-зера составляла 4.2 • 10-3 Дж/см2. Эта величина оказалась самой низкой по сравнению с пороговыми величинами плотности энергии излучения других длин волн, также изменявших характеристики импульсного ответа афферентов ямкового
органа гремучей змеи (Мо18еепкоуа et а1., 2003). Успешная попытка поиска молекулярной мишени, отвечающей на воздействие низкоинтенсивного (не приводящего к изменению температуры исследуемого объекта) ИК-излучения, была осуществлена при исследовании импульсной активности мембраны нейрона - рецептора растяжения ракообразных (Павленко и др., 1975). Цитируемые авторы показали, что излучение спектральной области 0.8-3 мкм вызывает снижение частоты импульсации нейрона. Снижение частоты повторных ответов было обусловлено активацией насосной функции Ка+,К+-АТФазы. Ионные механизмы воздействия низкоинтенсивного ИК-из-лучения спектрального диапазона 1-56 мкм на мембраны сенсорных нейронов теплокровных животных были исследованы при помощи метода локальной фиксации потенциала. Было обнаружено, что под действием низкоинтенсивного ИК-излучения происходит снижение потенциа-лочувствительности активационного воротного
устройства медленных натриевых (N^1.8) каналов (Плаховаи др., 2003). Обнаруженный эффектустра-нялся уабаином, блокатором насосной и транс-дукторной функции №+,К+-АТФазы. Этот факт свидетельствовал о том, что №+,К+-АТФаза принимает участие в рецепции ИК-излучения.
При исследовании ответов нейрона - рецептора растяжения ракообразных на действие излучения ближнего и среднего ИК-диапазонов было установлено, что пороговая плотность мощности излучения, вызывающего реакцию нейрона, проявляющуюся в гиперполяризации мембраны и в снижении частоты его импульсной активности, уменьшалась на семь порядков величины (от 0.45 до 2 • 10-8 Вт/ см2) при переходе от спектральной области 0.8-3 мкм к длине волны 10.6 мкм, генерируемой СО2-лазером (Кучерявых и др., 2003).
Известно, что №+,К+-АТФаза, помимо своей основной функции активного транспорта ионов, участвует в механизмах клеточной сигнализации в качестве трансдуктора сигналов (Крылов и др., 1999; Х1е, 2001). Задача настоящей работы - исследование молекулярного механизма взаимодействия излучения СО2-лазера с мембраной ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев теплокровных животных и выяснение роли №+,К+-АТФазы как трансдуктора сигнала, индуцируемого ИК-излучением.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполняли на культивируемых изолированных сенсорных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Wistar. Небольшие темные нейроны отличаются высокой плотностью устойчивых к воздействию тетродо-токсина (TTX) натриевых каналов Nav1.8 (Gold et al., 1996; Kirchhoff, 1989). Известно, что в этой популяции сенсорных С-нейронов широко представлены и ноцицептивные нейроны, афферентные волокна которых также устойчивы к действию ТТХ (Ревенко и др., 1997). Для выделения нейронов применяли модифицированный метод краткосрочного культивирования (Elliott, Elliott, 1993), обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. Использованная методика выделения подробно описана ранее (Плахова и др., 2003). В работе применяли следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: NaCl - 65, CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, Choline Cl - 70, HEPES-Na -10, TTX - 0.0001, pH = 7.4. Внутриклеточный раствор: CsF - 100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCl2 - 2,
Рис. 1. Установка для измерения ионных токов методом локальной фиксации потенциала, совмещенная с оптической схемой, в состав которой входит СО2-ла-зер
1, 4 - оптические клинья, 2 - измеритель мощности, 3 - механический экран, 5 - полупроводниковый лазер, 6 - дисковый ослабитель, 7, 8 - зеркала.
HEPES-Na - 10, pH = 7.2. Исключение из растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе блокировали кальциевые токи (Kostyuk et al., 1975). Наличие во внеклеточном растворе ионов ТТХ обеспечивало блокирование быстрых ТТХ-чувствительных каналов, что делало возможным регистрировать ответы только одной популяции ионных каналов - медленных ТТХ-резистентных натриевых каналов Nav1.8. В работе использованы реактивы фирмы "Sigma". Оптическая схема установки представлена на рис. 1. Источником излучения, длина волны которого составляла 10.6 мкм, являлся непрерывный СО2-лазер. Мощность излучения контролировали в пучке, отраженном от передней поверхности оптического клина (1), измерителем мощности типа ИМО-2Н (2). Для визуализации положения луча СО2-лазера в пространстве использовали полупроводниковый лазер (5) с длиной волны излучения 0.635 мкм, луч которого совмещали с ИК-лучом при помощи оптического клина (4). Варьирование мощности излучения осуществляли дисковым ослабителем (6). Зеркалами (7, 8) излучение направляли в экспериментальную ванночку с наружным раствором, в котором находился нейрон. Диаметр ван-
ночки равнялся 0.8 см, высота 0.18 см. Диаметр лазерного пучка в плоскости поверхности физиологического раствора в ванночке составлял 1 см. Подачу лазерного излучения на нейрон и прекращение облучения осуществляли при помощи механического экрана (3).
Измерения температуры физиологического раствора во время его облучении проводили с использованием калиброванной термопары Си-Со, защищенной от воздействия излучения специальным экраном. Термопару помещали в раствор до начала его облучения, при этом фиксировали начальную температуру раствора. Во время действия излучения на раствор и находящийся в нем нейрон осуществляли перфузию, обеспечивавшую полную смену внеклеточного раствора в ванночке за одну минуту.
Распределение мощности излучения по сечению лазерного пучка было измерено в отдельном опыте с помощью калиброванных диафрагм, располагавшихся в плоскости поверхности внеклеточного раствора. Мощность излучения, прошедшего диафрагму, измеряли дополнительным измерителем мощности типа ИМО-2Н, находившимся за диафрагмой.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Записи ответов медленных натриевых каналов проводили в режиме регистрации ионных токов целой клетки до (рис. 2, а) и после (б) трехминутного воздействия лазерного излучения. Амплитудные вольтамперные характеристики построены обычным способом (Hodgkin, Huxley, 1952a). При подаче на мембрану последовательности ступенек напряжения (Е) регистрировали амплитудные (пиковые) величины токов (Ipeak), которые затем были представлены как функции /peak(E). На рис. 3, а показаны нормированные вольтам-перные характеристики медленных натриевых каналов, полученные в контрольном эксперименте и после воздействия ИК-излучения. Эффект этого воздействия можно оценить количественно с помощью метода исследования предельной логарифмической чувствительности к потенциалу (Алмерс, 1981). Для этого была построена потенциалозависимость хордовой проводимости
^Na(^):
GNa(E) = Ipic(E)/(E - Er),
где Ег - величина потенциала реверсии натриевого тока. Функция GNa(E) имеет начальный S-образный участок, крутизна которого отражает
Рис. 2. Экспериментальные записи семейств медленных натриевых токов
а — семейство медленных натриевых токов в контрольных условиях, б — через 15 мин после воздействия излучения. Тестирующий потенциал изменялся с шагом 10 мВ. Поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 500 мс, был равен —110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом. Отметка времени 5.3 мс. Калибровка тока 400 рА (а) и 100 рА (б).
особенности потенциалочувствительности акти-вационного процесса. Изменение крутизны этого участка при воздействии излучения проявляется на графике зависимости нормированной хордовой проводимости
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.