УДК 577.24
ВОЗРАСТ-ЗАВИСИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ МИТОХОНДРИЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ © 2013 г. Л. Е. Бакеева1, 2*, В. Б. Вайс1, 2, И. М. Вангели1, 2
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40; *электронная почта: bakeeva@genebee.msu.ru 2Научно-исследовательский институт митоинженерии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 75В Поступила в редакцию 30.04.2013 г.
Проведено электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры митохондрий поперечнополосатых мышц при старении. Сравнили ультраструктуру митохондрий летательной мышцы Drosophi-1а melanogaster (молодые мухи — 1 сут, и старые — 36 сут), митохондрий кардиомиоцитов и скелетной мышцы крыс линий Ш81аг и ОХУ8 (молодых, 3 мес., и старых — в возрасте 25 мес.). Показано, что митохондрии летательной мышцы старых мух D. melanogaster содержат характерные нарушения ультраструктуры, соответствующие описанным ранее. В кардиомиоцитах старых крыс (как Ш81аг, так и ОХУ$) выявлены еще не описанные изменения ультраструктуры митохондрий. В красных волокнах скелетной мышцы старых крыс ОХУ8 обнаружены значительные изменения ультраструктуры субсарколеммаль-ных митохондрий. Показано, что субсарколеммальные митохондрии красных мышечных волокон — это особая популяция митохондрий, обладающих атипичной ультраструктурой. Начальные изменения ультраструктуры субсарколеммальных митохондрий обнаружены уже у 3-месячных крыс ОХУ$. В то же время митохондрии скелетной мышцы старых крыс Ш81аг сохраняют свои морфологические характеристики и соответствуют по ультраструктуре митохондриям скелетной мышцы 3-месячных крыс Ш81аг.
Ключевые слова: митохондрии, ультраструктура, старение.
Б01: 10.7868/80233475513050022
Согласно современным представлениям, в основе возраст-зависимого повреждения ткани и старения лежит действие окислительного стресса и повышенной продукции активных форм кислорода (АФК). Митохондрии считаются основным источником АФК, поэтому функциональные и структурные характеристики митохондрий при старении объясняют в рамках свободно-радикальной теории Хармана [1].
Изменения ультраструктуры митохондрий при старении изучены в меньшей степени, чем функциональные. Возрастные изменения ультраструктуры митохондрий различных тканей (в том числе миокарда и скелетной мышцы) имеют целый ряд сходных признаков: набухание митохондрий, редукция крист, просветление матрикса, повреждение митохондриальных мембран [2—7]. Методами морфометрического ультраструктурного анализа показано, что при старении в ткани миокарда хомячка уменьшается величина отношения поверхности внутренней митохондриаль-ной мембраны к объему митохондрий [8], а у мышей линии С57БЬ/6 наблюдается укорочение длинной оси и удлинение короткой оси митохондрий [9]. В биопсийном материале скелетной
мышцы пожилых людей (69—70 лет) снижено число митохондрий в субсарколеммальной области [10] и межфибриллярных митохондрий [11]. В то же время Томанек и Карлсон [12] провели подробный анализ ультраструктуры миокарда молодых (3—6 мес.) и старых (27—28 мес.) крыс и не обнаружили таких описанных ранее возраст-зависимых изменений митохондрий, как фрагментация крист и уменьшение плотности матрикса. Рива и соавт. [13], исследуя методом сканирующей электронной микроскопии ультраструктуру митохондрий миокарда крыс при старении, также не обнаружили деструктивных изменений крист. Известны только две модели — Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster — на которых установлена корреляция между структурными параметрами митохондрий и их энергетическим режимом в процессе старения. На этих моделях однозначно показано, что кислородный стресс играет важную роль в обусловленных возрастом изменениях ультраструктуры митохондрий [14—16]. Известно, что от окислительного повреждения митохондрий наиболее сильно страдают мозг и мышечная ткань [17]. Поэтому изучение ультраструктуры митохондрий этих тканей чрезвычайно актуально.
Мы провели сравнительный анализ возрастных изменений ультраструктуры митохондрий летательной мышцы, кардиомиоцитов, скелетной мышцы. С этой целью изучали морфологию митохондрий летательной мышцы D. melanogaster (мухи в возрасте 1 и 36 сут; продолжительность жизни особей данной линии 40—50 дней), кардиомиоцитов крыс линии Wistar и линии OXYS (25 мес.), скелетной мышцы крыс линии Wistar и линии преждевременно стареющих крыс OXYS (3 и 25 мес.).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали по пять животных каждой возрастной группы для каждого типа ткани. Для получения препаратов летательной мышцы грудной сегмент мухи D. melanogaster помещали на 1ч в охлажденный фиксатор, после чего летательную мышцу выделяли механически с использованием стереомикроскопа LEIKA MZ12.5. Животные были любезно предоставлены Е.Г Пасюковой (Институт молекулярной генетики РАН, Москва).
Для изучения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс использовали ткань левого желудочка. Материал забирали сразу после дека-питации животного. Препараты скелетных мышц получали из фрагментов икроножной мышцы, взятой из голени животных после декапитации. Экспериментальный материал крыс линий Wistar и OXYS был любезно предоставлен Н.Г. Колосовой (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).
Образцы ткани для электронно-микроскопического исследования фиксировали в течение 1 ч 4% глутаровым альдегидом на 0.1 М фосфатном буфере при рН 7.2—7.4. После фиксации глутаро-вым альдегидом ткань промывали в течение 30 мин 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.2—7.4). Далее проводили фиксацию 1% OsO4 на фосфатном буфере в течение 1.5—2 ч. После фиксации материал обезвоживали (по 30—40 мин) в серии спиртов возрастающей концентрации. 70-градусный спирт содержал насыщенный раствор (1.5%) уранилацетата. В этом растворе материал оставляли на 12—20 ч при температуре 4—5°С. После процедуры обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолу Эпон-812. Исследуемый материал резали на ультрамикротоме Ultracut III фирмы Leica. Препараты красили свинцом по Рей-нольдсу. Ультраструктуру митохондрий изучали при помощи электронных микроскопов Hitachi — HU-11, HU-12, JEM-1400.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлена ультраструктура митохондрий летательной мышцы имаго D. melanogaster в возрасте 36 дней. Практически во всех митохондриях видны деструктивные изменения. Так, в локальных участках митохондрий наблюдается пространственная реорганизация внутренней мем-
браны: исчезают правильно расположенные пластинчатые кристы, мембраны образуют слоистую структуру, в которой невозможно различить матрикс и межмембранное пространство. В дальнейшем в митохондриях образуются концентрические слои электронно-плотных мембран, которые постепенно увеличиваются и в конце концов приводят к полному разрушению митохондрий [18]. Ультраструктура митохондрий летательной мышцы молодых (1 сут) особей D. melanogaster соответствовала классическим представлениям о строении митохондрий летательной мышцы насекомых (рис. 2).
В рамках современных представлений о механизмах старения исследовали влияние кислородного стресса на ультраструктуру митохондрий Drosophila (штамм white1118) [16]. Оказалось, что воздействие гипероксии в течение 4 дней на 3— 4-дневных особей приводит к появлению изменений ультраструктуры, характерных для старения, в 35% митохондрий; воздействие гипероксии в течение 7 дней вызывало характерные деструктивные изменения в 62% митохондрий, в то время как у контрольных особей такие изменения отсутствовали или были единичными.
На основе данных [15] о том, что в дефектных по ультраструктуре зонах митохондрий — миели-ноподобных образованиях — цитохром-с-окси-дазная активность не выявляется, в отличие от нативной части митохондрий, сделан вывод, что возникновение миелиноподобных образований под действием кислородного стресса связано с появлением дефектов в компонентах дыхательной цепи, локальной потерей цитохром-с-окси-дазной активности и конформационными изменениями цитохрома с.
Ультраструктура митохондрий кардиомиоци-тов также подвергается значительным изменениям, обусловленным возрастом. Мы наблюдали общую реорганизацию митохондриального аппарата кардиомиоцитов крыс Wistar и OXYS в возрасте 25 мес., а также изменения ультраструктуры отдельных митохондрий. Эти изменения были наиболее выражены у крыс линии OXYS. На рис. 3 и 4 представлена ультраструктура митохондрий кардиомиоцитов крыс OXYS в возрасте 3 и 25 мес. соответственно. Можно видеть, что в митохондриях кардиомиоцитов старых крыс кристы внутренней митохондриальной мембраны утрачивают правильное, взаимно параллельное расположение, возникают локальные миелиноподобные концентрические образования или отдельные стопки мембран. Пространство матрикса значительно увеличено и заполнено зернистым материалом.
Атипичная, не описанная ранее реорганизация ультраструктуры митохондрий обнаружена нами в скелетной мышце крыс OXYS в возрасте 25 мес. На рис. 5 представлены субсарколеммаль-ные митохондрии красного мышечного волокна таких крыс. Морфологическая организация этих
щ я •• К Ю» '4 « ' •
*Шг & '-Ьи- дай?;
V ' »а; • к. ■ V:;-
щ Ш ?' - ■ ~ .ша г ; - ш
V ; 'ч ^-..^Е ш. я ш
ж ■ /4 >' " , ¡¿/¡г ш ?4 ш
11 • Л, у У..''-"»«»а« «да: т
Рис. 2 Ультраструктура митохондрий летательной мышцы Б. melanogaster (1 сут после рождения).
шш
'V? V ч
£
1 г.
Окяй|
0.5 мкм
Рис. 1 Ультраструктура митохондрий летательной мышцы Б. melanogaster (36 дней).
митохондрий не соответствует хорошо известной ультраструктуре митохондрий скелетных мышц. Мы видим необычные протяженные змеевидные структуры с локальными расширениями. Тонкие змеевидные тяжи этих митохондрий образованы расположенными вдоль двумя—тремя протяженными кристами, чередующимися с локальными расширениями. Локальные расширения — это значительно увеличенное межмембранное пространство, которое содержит концентрические слои крист и заполнено гомогенным веществом. Обычно межмембранное пространс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.