РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 10-15
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ПОТОМСТВА САМОК МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ОДНОКРАТНОМУ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ
© 2014 г. С.С. Обернихин, Н.В. Яглова
ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, г. Москва, Россия Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014
Aктивация иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности на постнатальный морфогенез и функционирование иммунной системы потомства является возможной причиной нарушений ее функционирования. Целью настоящего исследования было выявление различий возрастной динамики субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки потомства самок мышей C57BL/6, подвергшихся однократному воздействию конканавалина А на ранних сроках беременности. Установлено, что активация иммунной системы матери на ранних сроках беременности приводит к замедлению постнатального развития лимфоидных образований селезенки потомства и нарушению субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки. Изменяется возрастная динамика содержания дифференцированных лимфоцитов, соотношение Т- и В-клеток с относительным дефицитом Т-клеток и увеличением количества В1-клеток в популяции В-клеток, уменьшается количество естественных киллеров.
Ключевые слова: лимфоциты, селезенка, пренатальное воздействие, конканавалин А
ВВЕДЕНИЕ
Одной из актуальных и малоизученных проблем биологии и медицины является влияние реакций иммунной системы материнского организма на развитие иммунной системы плода. Формирование органов иммунной системы плода во многом определяется реактивностью иммунной системы матери [1]. По мнению ряда специалистов, активация иммунной системы матери во время беременности может приводить к нежелательным последствиям в формировании у потомства врождённого и приобретенного иммунитета [2]. Одним из наименее изученных аспектов проблемы является возможность влияния активации иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности на постнатальный морфогенез и функционирование иммунной системы потомства. В пре-
Адрес: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3. НИИ морфологии человека РАМН, Обернихину С.С. E-mail: ober@mail.ru
дыдущих исследованиях нами было установлено, что у потомства мышей, подвергшегося пренатальному воздействию конканавалина А (Кон А) на 7-е сутки эмбрионального развития отмечается пониженная цитотоксическая активность клеток селезенки и более высокие темпы гибели после имплантации клеток ме-ланомы [3]. Целью настоящего исследования было выявление различий возрастной динамики субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздействию Кон А на ранних сроках беременности.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Лабораторные животные
Исследования проводили на самцах мышей C57BL/6 (питомник «Столбовая») в возрасте 17 сут. (после перехода на самостоятельное вскармливание) и 1,5 мес. (пубертатный период). Самцы опытной группы (п = 20) получены от самок, которым на 7-е сутки после
оплодотворения, то есть до формирования органов иммунной системы плода, в качестве активатора иммунной системы был однократно введён в орбитальный синус Кон А («Sigma», США) в дозе 5мг/кг. Беременность определяли и датировали по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке и/или по наличию влагалищной пробки. В качестве контрольной группы использовали самцов мышей C57/BL6 (n = 20), родившихся от интактных самок. Животных выводили из эксперимента передозировкой золетила. Эксперимент проведен в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977 г.
Морфологические исследования
Удаленные селезенки у половины мышей опытной (n = 10) и контрольной (n = 10) групп в возрасте 17 суток и 1,5 мес. взвешивали, определяли их относительную массу, после чего фиксировали в растворе Буэна. После стандартной гистологической проводки и заливки в парафин изготавливали препараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили гистологическое исследование препаратов селезёнки методом световой микроскопии и компьютерной морфометрии с помощью программы «ImageScope» («Leica Microsystems Gmbh», Австрия). Определяли объемную долю белой пульпы. Селезенки остальных мышей опытной и контрольной групп использовали для проведения цитофлу-ориметрического исследования.
Цитофлуориметрическое исследование
После лизиса эритроцитов 0,83%-ным раствором хлорида аммония 106 взвеси клеток селезенки инкубировали с соответствующими моноклональными антителами в течение 20 мин. Не связавшиеся антитела отмывали добавлением среды RPMI. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, клетки встряхивали вортексом, ресуспен-дировали 0,5 мл культуральной среды.
Определение процентного соотношения Т-, NK, NKT, В-клеток проводили с использованием проточного цитофлуориметра «Cytomix FC 500» («Beckman Coulter»). Использовали конъюгаты антител с флюорохромами
(«еВ^оепсе, 1пс») к антигенам мыши для определения: CD3e-phycoerythrin-cyanine 7 (клон 145-211) — Т-клетки, CD4-phycoerythrin (клон GK1.5) — Т-хелперы, CD8a-phycoerythrin-cyanine 5 (клон 53-6.7) — Т-ци-тотоксические лимфоциты, N0.1^11^ (клон РК136) — NK-клетки, aGalactosylceramide CD1d-phycoerythrin (клон Ь363) — инвариантные NKT-клетки, CD19-phycoerythrin-cyanine 5 (клон eBio1D3) — В-клетки, CD5-FITC (клон 53-7.3) — В1-клетки, CD23-phycoerythrin (клон В3В4) — активированные В-клетки, несущие рецептор FcYRП.
Статистическая обработка
Для обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 7.0 («Statsoft», США). Для описания количественных признаков проводили анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения т. Сравнение независимых групп по количественному признаку проводили с помощью ^критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, а также критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфологическое исследование селезенки
Относительная масса селезенки потомства в возрасте 17 сут. была меньше значений контрольной группы, но эти различия не достигли статистической значимости (рис. 1). К 1,5-месячному возрасту относительная масса органа снизилась у мышей обеих групп, но в опытной группе этот показатель был статистически значимо ниже, чем в контрольной.
При гистологическом исследовании селезенки мышей контрольной группы было выявлено увеличение доли белой пульпы в среднем на 32,8% с 17-го дня к 1,5 месяцам постнатального развития. У мышей опытной группы в возрасте 17 сут. и 1,5 мес. доля белой пульпы была меньше, но, как и в случае с
12 70 60 50
17 сут. □ контрольная группа
1,5 мес.
□ опытная группа
17 сут. □ контрольная группа
1,5 мес. □ опытная группа
Рис. 1. Возрастные изменения относительной массы селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки беременности (опытная группа), и интактных самок (контрольная группа), (M±m).
Рис. 2. Возрастные изменения доли белой пульпы селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки беременности (опытная группа), и интактных самок (контрольная группа), (M±m).
относительной массой, эти различия достигли статистической значимости к 1,5-меячному возрасту. Увеличение доли белой пульпы также было менее выражено и составило в среднем 28,23% (рис. 2).
Цитофлуориметрическое исследование
При динамическом анализе численности субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей контрольной группы были выявлены характерные для развития данного органа в течение первых месяцев жизни увеличение доли Т-клеток, с постепенным увеличением доли Т-цитотоксических лимфоцитов на фоне постоянного количества Т-хелперов, снижение количества дубль-позитивных CD4+CD8+ клеток, увеличение количества NK- и NKT-клеток. Популяция В-клеток характеризовалась постоянной численностью. С возрастом увеличивалась доля CD19 + CD5 + В1-клеток, а также наблюдалась активация В-клеток (табл. 1).
Динамическое исследование численности субпопуляций Т-, NK- и NKT-клеток селезенки мышей опытной группы выявило аналогичные возрастные изменения (табл. 1). Однако имелись существенные отличия на каждом сроке исследования. В возрасте 17 сут. у мышей опытной группы среди лимфоцитов селезенки Т-клетки встречались в
большем количестве, при этом процентное соотношение Т-хелперов, Т-цитотоксичес-ких лимфоцитов, а также количество дубль-позитивных CD4 + CD8+ не отличалось от значений контрольной группы. Выявлено меньшее количество NK-клеток. Доля инвариантных NKT-клеток и в целом CD3 + NK + клеток соответствовала значениям контрольной группы. Также у мышей опытной группы было выявлено большее количество В-клеток, в том числе и активированных CD19 + CD23 + В-клеток, в то время как количество В1-кле-ток и, соответственно, количество В1-акти-вированных клеток было значительно меньшим.
У мышей опытной группы в возрасте 1,5 мес. количество Т-клеток в селезенке увеличилось по сравнению с предыдущим сроком исследования в значительно меньшей степени, чем у мышей контрольной группы. Таким образом, на данном сроке исследования у мышей опытной группы количество Т-клеток в селезенке было почти в два раза меньше значений контрольной группы. Соотношение CD4 + CD8", CD4-CD8 + и CD4 + CD8+ соответствовало значениям контрольной группы. Несмотря на меньшее количество CD3+ клеток, доля CD3 + NK + клеток не отличалась от контрольных значений. Не наблюдалось и уменьшения популяции инвариантных NKT-клеток. Количество
Таблица 1. Динамика численности субпопуляций лимфоцитов селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.