научная статья по теме ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ПОТОМСТВА САМОК МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ОДНОКРАТНОМУ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ПОТОМСТВА САМОК МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ОДНОКРАТНОМУ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 10-15

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ПОТОМСТВА САМОК МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ОДНОКРАТНОМУ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА РАННИХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ

© 2014 г. С.С. Обернихин, Н.В. Яглова

ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, г. Москва, Россия Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014

Aктивация иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности на постнатальный морфогенез и функционирование иммунной системы потомства является возможной причиной нарушений ее функционирования. Целью настоящего исследования было выявление различий возрастной динамики субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки потомства самок мышей C57BL/6, подвергшихся однократному воздействию конканавалина А на ранних сроках беременности. Установлено, что активация иммунной системы матери на ранних сроках беременности приводит к замедлению постнатального развития лимфоидных образований селезенки потомства и нарушению субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки. Изменяется возрастная динамика содержания дифференцированных лимфоцитов, соотношение Т- и В-клеток с относительным дефицитом Т-клеток и увеличением количества В1-клеток в популяции В-клеток, уменьшается количество естественных киллеров.

Ключевые слова: лимфоциты, селезенка, пренатальное воздействие, конканавалин А

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных и малоизученных проблем биологии и медицины является влияние реакций иммунной системы материнского организма на развитие иммунной системы плода. Формирование органов иммунной системы плода во многом определяется реактивностью иммунной системы матери [1]. По мнению ряда специалистов, активация иммунной системы матери во время беременности может приводить к нежелательным последствиям в формировании у потомства врождённого и приобретенного иммунитета [2]. Одним из наименее изученных аспектов проблемы является возможность влияния активации иммунной системы материнского организма на ранних сроках беременности на постнатальный морфогенез и функционирование иммунной системы потомства. В пре-

Адрес: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3. НИИ морфологии человека РАМН, Обернихину С.С. E-mail: ober@mail.ru

дыдущих исследованиях нами было установлено, что у потомства мышей, подвергшегося пренатальному воздействию конканавалина А (Кон А) на 7-е сутки эмбрионального развития отмечается пониженная цитотоксическая активность клеток селезенки и более высокие темпы гибели после имплантации клеток ме-ланомы [3]. Целью настоящего исследования было выявление различий возрастной динамики субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки потомства самок мышей, подвергшихся однократному воздействию Кон А на ранних сроках беременности.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные

Исследования проводили на самцах мышей C57BL/6 (питомник «Столбовая») в возрасте 17 сут. (после перехода на самостоятельное вскармливание) и 1,5 мес. (пубертатный период). Самцы опытной группы (п = 20) получены от самок, которым на 7-е сутки после

оплодотворения, то есть до формирования органов иммунной системы плода, в качестве активатора иммунной системы был однократно введён в орбитальный синус Кон А («Sigma», США) в дозе 5мг/кг. Беременность определяли и датировали по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке и/или по наличию влагалищной пробки. В качестве контрольной группы использовали самцов мышей C57/BL6 (n = 20), родившихся от интактных самок. Животных выводили из эксперимента передозировкой золетила. Эксперимент проведен в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977 г.

Морфологические исследования

Удаленные селезенки у половины мышей опытной (n = 10) и контрольной (n = 10) групп в возрасте 17 суток и 1,5 мес. взвешивали, определяли их относительную массу, после чего фиксировали в растворе Буэна. После стандартной гистологической проводки и заливки в парафин изготавливали препараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили гистологическое исследование препаратов селезёнки методом световой микроскопии и компьютерной морфометрии с помощью программы «ImageScope» («Leica Microsystems Gmbh», Австрия). Определяли объемную долю белой пульпы. Селезенки остальных мышей опытной и контрольной групп использовали для проведения цитофлу-ориметрического исследования.

Цитофлуориметрическое исследование

После лизиса эритроцитов 0,83%-ным раствором хлорида аммония 106 взвеси клеток селезенки инкубировали с соответствующими моноклональными антителами в течение 20 мин. Не связавшиеся антитела отмывали добавлением среды RPMI. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, клетки встряхивали вортексом, ресуспен-дировали 0,5 мл культуральной среды.

Определение процентного соотношения Т-, NK, NKT, В-клеток проводили с использованием проточного цитофлуориметра «Cytomix FC 500» («Beckman Coulter»). Использовали конъюгаты антител с флюорохромами

(«еВ^оепсе, 1пс») к антигенам мыши для определения: CD3e-phycoerythrin-cyanine 7 (клон 145-211) — Т-клетки, CD4-phycoerythrin (клон GK1.5) — Т-хелперы, CD8a-phycoerythrin-cyanine 5 (клон 53-6.7) — Т-ци-тотоксические лимфоциты, N0.1^11^ (клон РК136) — NK-клетки, aGalactosylceramide CD1d-phycoerythrin (клон Ь363) — инвариантные NKT-клетки, CD19-phycoerythrin-cyanine 5 (клон eBio1D3) — В-клетки, CD5-FITC (клон 53-7.3) — В1-клетки, CD23-phycoerythrin (клон В3В4) — активированные В-клетки, несущие рецептор FcYRП.

Статистическая обработка

Для обработки полученных данных использовали компьютерную программу Statistica 7.0 («Statsoft», США). Для описания количественных признаков проводили анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения т. Сравнение независимых групп по количественному признаку проводили с помощью ^критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, а также критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологическое исследование селезенки

Относительная масса селезенки потомства в возрасте 17 сут. была меньше значений контрольной группы, но эти различия не достигли статистической значимости (рис. 1). К 1,5-месячному возрасту относительная масса органа снизилась у мышей обеих групп, но в опытной группе этот показатель был статистически значимо ниже, чем в контрольной.

При гистологическом исследовании селезенки мышей контрольной группы было выявлено увеличение доли белой пульпы в среднем на 32,8% с 17-го дня к 1,5 месяцам постнатального развития. У мышей опытной группы в возрасте 17 сут. и 1,5 мес. доля белой пульпы была меньше, но, как и в случае с

12 70 60 50

17 сут. □ контрольная группа

1,5 мес.

□ опытная группа

17 сут. □ контрольная группа

1,5 мес. □ опытная группа

Рис. 1. Возрастные изменения относительной массы селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки беременности (опытная группа), и интактных самок (контрольная группа), (M±m).

Рис. 2. Возрастные изменения доли белой пульпы селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки беременности (опытная группа), и интактных самок (контрольная группа), (M±m).

относительной массой, эти различия достигли статистической значимости к 1,5-меячному возрасту. Увеличение доли белой пульпы также было менее выражено и составило в среднем 28,23% (рис. 2).

Цитофлуориметрическое исследование

При динамическом анализе численности субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей контрольной группы были выявлены характерные для развития данного органа в течение первых месяцев жизни увеличение доли Т-клеток, с постепенным увеличением доли Т-цитотоксических лимфоцитов на фоне постоянного количества Т-хелперов, снижение количества дубль-позитивных CD4+CD8+ клеток, увеличение количества NK- и NKT-клеток. Популяция В-клеток характеризовалась постоянной численностью. С возрастом увеличивалась доля CD19 + CD5 + В1-клеток, а также наблюдалась активация В-клеток (табл. 1).

Динамическое исследование численности субпопуляций Т-, NK- и NKT-клеток селезенки мышей опытной группы выявило аналогичные возрастные изменения (табл. 1). Однако имелись существенные отличия на каждом сроке исследования. В возрасте 17 сут. у мышей опытной группы среди лимфоцитов селезенки Т-клетки встречались в

большем количестве, при этом процентное соотношение Т-хелперов, Т-цитотоксичес-ких лимфоцитов, а также количество дубль-позитивных CD4 + CD8+ не отличалось от значений контрольной группы. Выявлено меньшее количество NK-клеток. Доля инвариантных NKT-клеток и в целом CD3 + NK + клеток соответствовала значениям контрольной группы. Также у мышей опытной группы было выявлено большее количество В-клеток, в том числе и активированных CD19 + CD23 + В-клеток, в то время как количество В1-кле-ток и, соответственно, количество В1-акти-вированных клеток было значительно меньшим.

У мышей опытной группы в возрасте 1,5 мес. количество Т-клеток в селезенке увеличилось по сравнению с предыдущим сроком исследования в значительно меньшей степени, чем у мышей контрольной группы. Таким образом, на данном сроке исследования у мышей опытной группы количество Т-клеток в селезенке было почти в два раза меньше значений контрольной группы. Соотношение CD4 + CD8", CD4-CD8 + и CD4 + CD8+ соответствовало значениям контрольной группы. Несмотря на меньшее количество CD3+ клеток, доля CD3 + NK + клеток не отличалась от контрольных значений. Не наблюдалось и уменьшения популяции инвариантных NKT-клеток. Количество

Таблица 1. Динамика численности субпопуляций лимфоцитов селезенки у самцов мышей C57BL/6, родившихся от самок, получавших Кон А в ранние сроки б

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком