МЕХАНИЗМЫ НОРМАЛЬНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ ТКАНЕЙ
УДК 616-018:57.022:576.08
ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЧИСЛА ТУЧНЫХ КЛЕТОК
И ЭОЗИНОФИЛОВ В КОЖЕ ЧЕЛОВЕКА © 2013 г. В. В. Петров, О. В. Васильева, Н. К. Корнилова, А. Г. Гунин
Чувашский государственный университет, 428015 Чебоксары, Московский пр-т, д. 15 E-mail: histol@mail.ru Поступила в редакцию 16.08.12 г.
Окончательный вариант получен 20.12.12 г.
В настоящем исследовании проведен анализ содержания одних из эффекторов воспаления — тучных клеток и эозинофилов — в дерме людей разных возрастов. Исследование показало, что число тучных клеток в дерме постепенно увеличивается с возрастом. Эозинофилы очень редко встречаются в дерме человека. Не отмечено возрастных изменений числа эозинофилов в дерме. Установлено возрастное снижение числа фибробластов в дерме человека. Процент PCNA+ (proliferating cells nuclear antigen; ядерный антиген пролиферирующих клеток) фибробластов, демонстрирующая их пролиферативный пул, также достоверно снижается с прогрессированием возраста. Результаты корреляционного анализа показывают, что возрастное увеличение числа тучных клеток достоверно (p < 0.05) взаимосвязано с уменьшением общего количества и процента PCNA+ фибробластов в дерме. Следовательно, можно предположить, что возрастание числа тучных клеток в дерме человека с возрастом является одним из механизмов, участвующих в воспалении и появлении признаков старения. Возможно, что тучные клетки, количество которых увеличивается в дерме с возрастом, оказывают влияние на возрастное уменьшение числа фибробластов в дерме.
Ключевые слова: кожа, старение, тучные клетки, эозинофилы, фибробласты, пролиферация, PCNA.
DOI: 10.7868/S0475145013030051
ВВЕДЕНИЕ
На протяжении жизни кожа у человека претерпевает комплекс морфофункциональных изменений. Главное место среди них занимают изменения в состоянии межклеточного вещества дермы, где происходит ферментативное разрушение и замедление синтеза новых коллагеновых и эластических волокон, уменьшение содержание гиалуроновой кислоты и протеогликанов. Кроме того, в дерме наблюдается изменение архитектоники волокон и накопление фрагментированных коллагеновых и эластических волокон (Kohl et al., 2011; Naylor etal., 2011). Волокна и аморфный компонент соединительной ткани, как и ферменты, участвующие в их разрушении, являются продуктами клеток, локализованных в дерме. Вполне очевидно, что при наличии изменений в составе межклеточного вещества должны происходить изменения и в клеточном составе дермы. Однако возрастные изменения клеточной популяции дермы плохо охарактеризованы. Данные по этому вопросу порой имеют противоречивый характер. К настоящему времени хорошо известно, что с возрастом в дерме человека уменьшается численность фибробластов (Khavkin, Ellis, 2011). Вместе с тем остаются неиз-
вестными фенотипические особенности, функциональная активность дермальных фибробластов в возрастном аспекте. Кроме фибробластов, в дерме присутствуют множество клеток костномозговой природы. К ним относятся лейкоциты, тучные клетки, натуральные киллеры, гематопоэтические стволовые клетки (Rijken, Bruijnzeel, 2009; Vuk-manovic-Stejic et al., 2011; Wang et al., 2012). Изменения в содержании и функциональной активности всех этих клеток изучены в основном в моделях индуцированного старения кожи, в то время как физиологически возрастные изменения остаются неизвестными (Cho et al., 2009; Kim et al., 2009; Rijken, Bruijnzeel-Koomen, 2011). Имеются противоречивые сведения о возрастных изменениях содержания тучных клеток в дерме человека (Ener-back, Wingren, 1980; Gilchrest et al., 1982; Montagna, Carlisle, 1990). Однако к настоящему времени нет убедительных данных о численности тучных клеток в дерме человека с фетального периода до глубокой старости. Сведения о возрастных изменениях в состоянии популяции эозинофилов в дерме человека отсутствуют в литературе.
Тучные клетки вырабатывают множество высокоактивных биологических продуктов, включая
179
3*
протеолитические ферменты, факторы роста, ци-токины, простагландины, гистамин (Gilfillan et al., 2011; Tsai et al., 2011). Эозинофилы также являются клетками с активной секреторной деятельностью. Среди их секреторных продуктов можно выделить главный основной белок, катионные белки, Р-глюкоуронидазу, нейротоксин эозинофилов, которые обладает выраженной цитотоксичностью (Akuthota, Weller, 2012). Кроме того, эозинофилы продуцируют интерлейкины, колониестимулиру-ющие факторы, трансформирующий фактор-р1, остеопонтин, сосудистый эндотелиальный фактор роста, металлопротеиназы, простагландины, фактор некроза опухолей-а (Kita, 2011). Многие секреторные продукты тучных клеток и эозинофилов оказывают влияние на состояние клеток и внеклеточный матрикс окружающей их соединительной ткани (Iddamalgoda et al., 2008; Amin, 2012). Учитывая это, можно предположить о существенном вкладе этих клеток в возрастные изменения межклеточного вещества дермы и жизнедеятельности фибробластов, и появлении клинических признаков старения кожи. Поэтому наше исследование было сфокусировано на изучении возрастных изменений тучных клеток и эозинофилов в дерме человека.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Для работы использовали полученные при аутопсии кусочки кожи с нижней части передней поверхности шеи (верхний угол стандартного разреза кожи при аутопсии) у плодов человека, умерших антенатально на сроке 20—40 недель беременности, и у людей, умерших от различных причин в возрасте от 1 дня до 85 лет. Материал фиксировали в 4% растворе формальдегида, заливали в парафин с последующим изготовлением поперечных срезов толщиной 5—7 мкм.
Тучные клетки выявляли с помощью анализа на триптазу, так как этот фермент является специфичным для тучных клеток (Gilfillan et al., 2011). В настоящее время триптаза рассматривается в качестве маркера тучных клеток (Gilfillan et al., 2011). При иммуногистохимическом выявлении трипта-зы в качестве первых антител использовали моно-клональные антитела к триптазе (M 7052, DakoCy-tomation, Дания) в разведении 1 : 400.
Эозинофилы визуализировали путем выявления главного основного белка эозинофилов. В качестве первых антител использовали два антитела разных производителей (CBL419, Chemicon International, Inc., Billerica, MA, USA; sc-59164, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) в разведении 1 : 50. Пролиферативную активность фиб-робластов оценивали путем выявления PCNA (proliferating cells nuclear antigen; ядерный антиген пролиферирующих клеток). PCNA+ клетки визуализировали непрямым иммуногистохимическим
методом (Gunin et al., 2004, 2005). В качестве первых антител использовали кроличьи поликлональ-ные антитела против PCNA (AHP1419, AbD Sero-tec, Oxford, UK) в разведении 1 : 100. Во всех случаях в качестве вторых антител использовали антикроличью EnVsion+ систему, конъюгированную с пероксидазой (K4000, K4002, DakoCytomation, Дания). Выявление активности пероксидазы осуществляли методом с 3,3-диаминобензидином (Sigma Chemical Co., США) и перекисью водорода. При данной процедуре продукт реакции окрашивается в коричневый цвет. Ядра клеток контрастировали помещением в гематоксилин на 5 мин. В качестве контроля специфичности иммуноцито-химического окрашивания применяли такую же процедуру обработки срезов, где вместо первых антител использовали нормальную козью сыворотку в конечной концентрации — 1%. При использовании такой схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. Детальная процедура иммуногистохимического окрашивания описана нами ранее (Gunin et al., 2005).
Число фибробластов определяли в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Число тучных клеток, эозинофилов, PCNA+ фибробла-стов и общее количество фибробластов определяли с помощью микроскопа Olympus CX-21, цифровой камеры Olympus Camedia 4040z и программы Sigma Scan Pro 5.0. Для этого находили участки дермы без волосяных фолликулов и кровеносных сосудов, которые фотографировали при увеличении объектива 40х (Gunin et al., 2004, 2005). Затем вычисляли площадь сфотографированных участков и подсчитывали количество соответствующих клеток в них. Как минимум 10 случайно выбранных участков среза кожи анализировали в каждом случае.
Для подсчета числа тучных клеток были использованы 156 кусочков кожи (110 мужчин и 46 женщин). Для анализа числа эозинофилов в дерме использовано 46 кусочков кожи. Для подсчета числа фибробластов были использованы 357 кусочков кожи (218 мужчин и 139 женщин). Для исследования числа PCNA положительных клеток было использовано 139 кусочков кожи (104 мужчины и 35 женщин). Для антенатального периода все случаи группировали в 10-недельные промежутки: 20—30 недель беременности (группа 1), 31—40 недель беременности (группа 2). Для постнатального периода все случаи группировали по 10-годичным интервалам: 1—10 лет (группа 3), 11—20 лет (группа 4), 21—30 лет (группа 5), 31—40 лет (группа 6), 41—50 лет (группа 7), 51— 60 лет (группа 8), 61—70 лет (группа 9). Группа 10 сформирована с 71 до 85 лет.
По каждой группе данных рассчитывали средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m). Достоверность влияния возраста или пола на исследуемые параметры кожи оцени-
- $ Щ * * Ч- лЛ ™ тр1 \ж 4 • ф щ т <С * . / . 1 , * • ч ^фЩ ф ЧГ- . » • ♦ ./ * - л г*м
V , _ # „ - * \ —— * *' т * «ь ^ ■ * V ♦ * , . *•- ' д.* > у ^ ** . V 7 / :
(а) , , (б) * \ . ■-1
Рис. 1. Тучные клетки (показаны стрелками) в коже человека при сроке беременности 32 недели (а) и в возрасте 62 лет (б). Видно существенное увеличение числа тучных клеток в дерме у человека 62 лет. Иммуногистохимическая реакция на триптазу тучных клеток. Участок шкалы — 50 мкм.
400
^ 300
Л
Я
м о н о
Р 200
й 3 я
100
(а)
ч о
Я ¡^
м м о н о
Р
й 3 я
20
а
ч о
Я ^
0 Я Я
1 -е-
о ^ £
О
Я 10
<ч о н о
а
ч я
о &
(б)
123456789 10 Возрастные группы
123456789 10 Возрастные группы
Рис. 2. Число тучных клеток (а), процентное соотношение тучных клеток к фибробластам (б) в дерме людей различного возраста (М ± т). Разделение на возрастные группы указано в разделе "Материалы и методы".
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.