ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 3, с. 171-182
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.170.49.546.59+577.21+612.015.31
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА В ОРГАНИЗМЕ КРЫС1
© 2004 г. Н. А. Платонова*, Э. А. Жигулева*, Н. В. Цымбаленко*, |Б. С. Мищенко**|, А. В. Васин**, Т. В. Живулько**, Л. В. Пучкова* **
*Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12 **Санкт-Петербургский государственный политехнический университет 195251 Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д. 29 Поступила в редакцию 28.04.03 г. Окончательный вариант получен 25.08.03 г.
У 7-суточных крыс (эмбриональный тип метаболизма меди) in vivo изучен биосинтез церулоплазми-на, медьсодержащего гликопротеина, играющего у позвоночных важную роль в переносе меди между органами и в двунаправленном клеточном транспорте железа. Установлено, что, помимо печени, церулоплазмин синтезируется в легких, мозгу и почках. Показано, что появление меченого церулоплазмина в кровотоке совпадает со временем освобождения новосинтезированного церуло-плазмина только из печени. [14С]-церулоплазмин из кровотока поглощается клетками сердца, легких, почек и связывается с красными клетками крови. В клетки мозга полипептидная цепь церулоплазмина из кровотока не поступает. В плазматических мембранах сердца, печени, почек и эритроцитов, но не мозга, методом иммуноблоттинга выявлены иммунореактивные полипептиды рецептора церулоплазмина. В клетках мозга обнаружена молекулярная форма церулоплазмина, связанная с плазматической мембраной. Методом обратной транскрипции, сопряженной с полиме-разной цепной реакцией, проведенной c помощью селективных праймеров, показано, что в составе этих клеток присутствуют молекулярные формы мРНК церулоплазмина, программирующие синтез как секреторного церулоплазмина, так и церулоплазмина, связанного с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь. После перехода на взрослый тип метаболизма меди на фоне резкого повышения содержания меди и церулоплазмина в сыворотке крови в спинномозговой жидкости содержание церулоплазмина, измеренное по оксидазной и антигенной активностям, а также концентрация меди, определенная методом атомно-абсорбционной спектрометрии, остаются низкими. Обсуждаются онтогенетические особенности системы, обеспечивающей гомеостаз меди у млекопитающих.
Ключевые слова: тканеспецифический синтез церулоплазмина, молекулярные формы церулоплазмина, рецептор церулоплазмина, эмбриональный тип метаболизма меди.
На всех этапах онтогенетического развития для нормального роста и функционирования организма необходимы ионы меди. Они входят в активные центры нескольких ключевых ферментов, контролирующих такие фундаментальные клеточные процессы, как окислительное фосфо-рилирование, транспорт железа через мембраны, формирование матрикса соединительной ткани, посттрансляционный процессинг предшественников нейропептидов (КагНп, 1993). Вместе с этим ионы меди могут участвовать в реакциях, проду-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 00-04-49597, 03-04-48748) и Федеральной целевой программой "Интеграция" (проект < И0064).
цирующих активные радикалы, которые нарушают структуру всех типов биомолекул (Linder, 2001). Поэтому неудивительно, что в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al., 1999), а их безопасный перенос осуществляет специальная система - метаболическая система меди (МСМ), некоторые гены которой недавно клонированы.
У млекопитающих транспорт меди обеспечивается согласованным взаимодействием ткане-специфических автономных МСМ, которые включают медьтранспортные АТФазы типа Р1, осуществляющие перенос ионов меди (Cu+) через мембраны, растворимые цитозольные Си+-шапе-роны, доставляющие медь к месту образования медьпротеидов, и, по-видимому, транскрипцион-
ные факторы, регулирующие активность генов МСМ, которые пока идентифицированы только у одноклеточных эукариот (Huffman, O'Halloran,
2001). МСМ отдельных органов и в целом подвергается изменчивости в течение онтогенеза, природа которой не изучена. Известно, что в период эмбрионального и раннего постнатального развития млекопитающих в печени функционирует МСМ эмбрионального типа (Hurley et al., 1980). В это время источником меди для тканей организма является церулоплазмин (ЦП), медьсодержащий гликопротеин, на долю которого приходится 95% неклеточной меди и который синтезируется в зависимости от периода развития клетками желточного мешка, плаценты или молочной железы соответственно (Баранов и др., 1986; Aldred et al., 1987; Пучкова и др., 19946; Cerveza et al., 2000; Пучкова и др., 2001). После поступления в организм экзогенно синтезированного ЦП часть ионов меди, связанных с ним, поглощается клетками печени (Cerveza et al., 2000) и не выводится через желчь, накапливаясь в ядрах и лизосомах клеток печени (Puchkova et al., 2002). При этом из-за низкой активности гена ЦП содержание меди в крови в несколько раз ниже, чем у взрослых.
Одним из основных признаков смены типа метаболизма меди, которое у крыс происходит на 13-е сут жизни, является повышение активности гена ЦП в печени, а также резкое увеличение содержания ЦП и соответственно меди в крови. У взрослых млекопитающих ЦП крови является источником меди для многих клеток негепатоци-тарных рядов (Cousin, 1985). У лабораторных крыс на 12-е сут эмбрионального развития, несмотря на поступление экзогенного ЦП, в клетках печени активируется ген ЦП, экспрессия которого остается на относительно низком уровне вплоть до окончания периода молочного вскармливания (Баранов и др., 1986; Пучкова и др., 1994а). Роль фетального ЦП при эмбриональном типе метаболизма меди остается неизвестной.
ЦП является не только универсальным внеклеточным транспортером меди, он также катализирует клеточный транспорт железа и участвует в антиоксидантной защите (Mukhopadyay et al., 1998; Danzeisen et al., 2000; Patel et al., 2002). Ген ЦП относится к уникальным генам (Fleming, Git-lin, 1990), а его мутации приводят к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний (Hellman et al.,
2002). Продуктами экспрессии этого гена являются несколько молекулярных форм, к которым помимо растворимых ЦП (Aldred et al., 1987) относятся внутриклеточный мембранный ЦП (Гайц-хоки и др., 1990; Danzeisen et al., 2000) и ЦП, связанный с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый (ГФИ) якорь (ГФИ-ЦП) (Patel, David, 1997). Образование различных форм ЦП связано с периодом онтогенеза,
формированием, дифференцировкой и инволюцией органов. Механизмы, лежащие в основе образования специфических форм ЦП при эмбриональном и взрослом типах метаболизма меди, нарушение которых может быть причиной различных заболеваний, почти не изучены.
Цель данной работы - изучение in vivo биосинтеза и распределения ЦП в организме новорожденных крыс. Для исследования были выбраны органы с различными типами метаболизма меди -печень, почки, мозг, легкие и сердце. У взрослых млекопитающих поглощение пищевой меди, ее распределение и экскреция осуществляется печенью (Pena et al., 1999). Именно здесь происходят центральные события при смене типа метаболизма меди в онтогенезе (Hurley et al., 1980; Bingle et al., 1991). В экскреции меди помимо печени также участвуют почки. Механизм, осуществляющий этот процесс, не изучен. Он, по-видимому, отличается от печеночного, так как при наследственном нарушении экскреции меди через желчь резко повышается выведение ее через почки (Owen, 1981).
Наиболее заметные изменения в содержании меди в течение онтогенеза происходят в мозгу. В результате перехода на взрослый тип метаболизма меди ее низкая концентрация у новорожденных повышается в несколько раз, и мозг становится лидирующим органом по содержанию меди (Mason, 1979). В легких ген ЦП активируется к концу эмбрионального периода и экспресси-руется только в первые дни жизни (Fleming, Gitlin, 1990). Предполагают, что это связано с адаптацией к дыханию атмосферным кислородом (Fleming et al., 1991).
Сердце относится к органам, в которых изменения метаболизма меди в течение онтогенеза не отмечены. Показано, что у взрослых млекопитающих источником меди для клеток сердца, почек, легких и мозга является ЦП, синтезируемый печенью. Но в отличие от клеток сердца, почек и легких клетки мозга не поглощают пептидную часть ЦП (Dunn et al., 1991).
Можно надеяться, что полученные данные помогут понять механизмы, лежащие в основе координированного взаимодействия автономных МСМ у млекопитающих в раннем онтогенезе, выработать стратегию поддержания гомеостаза меди, который у новорожденных особенно чувствителен к изменению ее содержания в пище (Muller et al., 1998; Prohaska, 2000).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на 7-суточных белых беспородных крысах вивария НИИ экспериментальной медицины, СПб. Сразу после рождения в пометах оставляли по восемь особей, в каждом опы-
те использовали крыс одного помета. Забор спинномозговой жидкости производили под эфирным наркозом из затылочной цистерны путем введения полиэтиленового капилляра, присоединенного к микрошприцу Гамильтон. В опытах крысам, голодавшим в течение 2 ч, с помощью гибкого зонда через пищевод вводили 0.4 мл физиологического раствора, содержащего 6.4 МБк [14С]-гидролизата белков хлореллы (40 МБк/мл, "Изотоп", Чехословакия), спустя 5 мин крысят возвращали кормящим самкам. Через различные интервалы времени из шейных сосудов собирали кровь в пробирки Эппендорф, предварительно смоченные цитратным буфером. Плазму и клетки крови разделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Клеточную фракцию трижды промывали центрифугированием в стандартном физиологическом растворе. Органы извлекали и помещали на охлажденные во льду чашки Петри. После взвешивания ткани гомогенизировали в соотношении 1 : 4 в 0.25 М растворе сахарозы, содержащем 20 мМ буфера mpuc-HCl, рН 7.4, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ фенилме-тилсульфонилфторида (ФМСФ) и 5 мМ 2-меркап-тоэтанола (все реактивы "Merck", Германия). Постмитохондриальный супернатант получали путем ц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.