ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 1, с. 61-69
УДК 577.115+577.125.33+597.55:591.2
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КАТАРАКТОГЕНЕЗА В МАЛЬКОВОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ СЕМГИ. II. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРУСТАЛИКА ПРИ КАТАРАКТОГЕНЕЗЕ
© 2004 г. Л. В. Тойвонен**, 3. А. Нефедова, В. С. Сидоров, Ю. Г. Юровицкий *
Институт биологии Карельского научного центра РАН
185610 Петрозаводск, ул. Пушкинская, д. 11 *Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119991 ГСП-1, Москва, ул. Вавилова, д. 26 **Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН 194223 Санкт-Петербург, пр-т М. Тореза, д. 44 Поступила в редакцию 19.10.00 г. Окончательный вариант получен 24.05.01 г.
Исследованы биохимические особенности липидного и фосфолипидного состава, а также характер жирнокислотных спектров в хрусталиках однолеток и двухлеток семги, пораженных катарактой. Установлены значительные изменения в липидном комплексе хрусталиков больных рыб. Показано, что катарактогенез сопровождается усилением свободнорадикального окисления и накоплением малонового диальдегида в хрусталиках семги разного возраста. Интенсификация окислительных процессов синхронизирована со снижением уровня антиоксидантной защиты (восстановленный глутатион, витамины А и Е). Определена активность Са2+-зависимых протеолитических ферментов в хрусталиках и показано снижение их активности при катаракте.
Ключевые слова: катарактогенез, хрусталик, мальки семги.
В последнее время на рыбоводных заводах Карелии при разведении хозяйственно-ценных видов лососевых возникло тяжелое заболевание глаз у молоди этих рыб - "белоглазие" (катаракта). Исследование оптомоторной реакции остроты зрения молоди семги, выращенной на Кем-ском и Выгском рыбоводных заводах, показало, что слабое зрение имели до 30%, а полную потерю зрения - до 35% всех выращенных рыб.
Изучение патогенеза заболевания позволило установить наличие у рыб ядерной формы катаракты. Реже наблюдаются другие формы катаракты и такие патологические изменения, как недоразвитие хрусталика и сужение зрачка. Катаракта появляется уже на первом году выращивания рыб, в возрасте 2-3 мес. Наиболее восприимчивы к данному заболеванию оказались озерный лосось (семга) и палия.
Поскольку в результате предварительных исследований паразитарная форма катаракты в данном случае исключается, наиболее вероятной причиной ее возникновения является алиментарный фактор.
Определение в кормах тех компонентов, недостаток которых может вызвать катаракту, сопряжено с большой затратой времени и значительными материальными издержками, однако в итоге достоверность заключений не гарантируется.
В то же время изучение биохимического статуса и обмена веществ у больных катарактой рыб по сравнению со здоровыми открывает новые возможности в оценке качества корма.
Кроме того, так как патологические изменения при катаракте у рыб, других животных и человека имеют однотипный биохимический базис (окислительное повреждение липидов и белков, деструкция мембран хрусталиковых волокон, нарушение образования высокомолекулярных белковых агрегатов), рыбы как объект исследования представляют особый интерес.
В данной работе проанализировали состав мембранных липидов хрусталика мальков семги и характер жирнокислотных спектров этих липидов при заболевании катарактой. Показано, что при катаракте происходит перераспределение ли-пидных фракций и возрастает соотношение холе-стерин/фосфолипиды (ХЛ/ФЛ).
Развитию рыбы сопутствует повышение антиокислительной активности ткани хрусталика, связанное со снижением в нем концентрации малонового диальдегида (МДА). Катарактогенез, напротив, сопровождается усилением свободно-радикального окисления и накоплением МДА. Рост окислительных процессов сопровождается снижением содержания глутатиона и жирорас-
творимых витаминов. Катарактогеиез синхронизирован со снижением активности протеолитиче-ского фермента кальпаина, которое наряду с другими факторами приводит к помутнению хрусталика.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили однолетки и двухлетки семги, выращенные на Выгском рыбоводном заводе. Исследовали хрусталики здоровых и больных катарактой рыб. В качестве общего контроля использовали рыбу, содержащуюся на кормах, не вызывающих "белоглазие". Из особей, получавших искусственный корм РГМ, отбирали рыбу, пораженную катарактой и имевшую только зрелую ядерную катаракту, для чего хрусталики исследовали микроскопически.
Фиксация материала, выделение, фракционирование и количественное определение липидов подробно описаны в предыдущей публикации (Тойвонен и др., 2003).
Регистрацию продуктов перекисного окисления липидов проводили с использованием цветной реакции 2-тиобарбитуровой кислоты с МДА (Владимиров, Арчаков, 1972).
Разделение и анализ жирорастворимых витаминов A и E осуществляли с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Руоколайнен и др., 1993).
Концентрацию глутатиона и белковых тиоло-вых групп определяли по методу Седлак (Sadlac, Lindsay, 1968).
Препараты кальцийактивируемой протеиназы -кальпаина получили из цитозольной фракции экстракта хрусталиков двухлеток семги. Цито-зольную фракцию хрусталиков наносили на колонку с ультрагелем AcA-34, уравновешенную буфером, и проводили элюцию этим же буферным раствором со скоростью 20 мл/ч при 4°С, используя аппаратуру для хроматографии (LKB "Pharmacia", Швеция). Активность обоих кальпа-инов определяли стандартным методом по гидролизу казеина (Murachi et al., 1981). Молекулярные массы кальпаинов определяли с помощью калибровочного графика, построенного по результатам пропускания через колонку с ультрагелем белков с известной молекулярной массой (трипсин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулин).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установление алиментарной природы катаракты у молоди семги. Поражение катарактой годовиков, получавших искусственный гранулированный корм РГМ, достигало 60%, двухгодови-ков - около 35%. Для выявления изменений в биохимическом статусе, сопутствующих возник-
новению и развитию катаракты, были проведены эксперименты по выращиванию молоди семги с добавкой к основному корму различных пищевых компонентов, а также полной заменой корма РГМ на ранее применявшиеся корма, содержащие свежую печень и селезенку и не приводящие к возникновению заболевания. В результате на чистом корме РГМ до 60% молоди семги заболевало катарактой, а при добавлении в корм до 10-15% сухого молока, а также витаминов С, Е, витаминизированного рыбьего жира, до 50% свежей печени и селезенки или при переходе на корма, состоящие из печени (35%), селезенки (30%) и витаминизированного рыбьего жира (3%), частота появления катаракты снижалась до 0.5-2.0%. Таким образом, была доказана алиментарная природа появления болезни на рыбоводных заводах Карелии.
Липидный состав хрусталиков сеголеток семги в норме и при катаракте. Идентификация основных фосфолипидных фракций показала наличие в хрусталиках мальков семги фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), сфингомие-лина (СфМ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и фос-фатидилсерина (ФС) (Тойвонен и др., 2001). Все названные липиды присутствовали как в нормальных, так и в пораженных катарактой хрусталиках.
При сравнительном изучении хрусталиков здоровых, без видимых признаков "белоглазия", и больных катарактой сеголеток семги было обнаружено повышение уровня общих липидов (табл. 1). В свою очередь фракции липидов претерпели количественные изменения, причем, как свидетельствуют данные табл. 1, рыба, относимая к условному контролю (так называемая норма), имела характеристики, отличающиеся от здоровой (контроль).
Обнаруженное увеличение содержания ХЛ у сеголеток семги совпадает с данными авторов, изучающих липиды в хрусталиках, подверженных катаракте, у других видов животных (СоШег й а1., 1978; Я^е^еМ, Брейог, 1981). Для хрусталиков сеголеток семги было показано повышение соотношения ХЛ/ФЛ от 0.69 до 1.0, что характеризует увеличение вязкости липидов.
Количественные изменения происходили также в фосфолипидных фракциях хрусталиков (табл. 1). При катаракте содержание ФХ возрастает, а ФС снижается. Найденные количественные изменения во фракциях фосфолипидов приводят к повышению коэффициента ФХ/ФС. Это свидетельствует об увеличении жесткости мембран хрусталика, обычно наблюдаемом при катаракте (Бабижаев, 1989).
У семги разного возраста изменения липидно-го и фосфолипидного спектра, сопутствующего катаракте, не были однотипными. При катаракте увеличение коэффициента ХЛ/ФЛ с 0.69 до 1.0
Таблица 1. Содержание липидов в хрусталиках сеголеток здоровой и пораженной катарактой семги, % от сухой
массы
Липиды Группы рыб
контроль норма катаракта
Общие 4.40 ± 0.30 5.20 ± 0.40 5.80 ± 0.50*
Фосфолипиды 2.30 ± 0.30 2.80 ± 0.20 2.70 ± 0.20
Холестерин 1.60 ± 0.20 2.00 ± 0.20 2.70 ± 0.40*
Триацилглицерины 0.20 ± 0.05 0.20 ± 0.04 0.40 ± 0.04
Эфиры холестерина 0.30 ± 0.03 0.20 ± 0.03* -
Фосфатидилхолин 0.50 ± 0.04 1.40 ± 0.10* 1.00 ± 0.10
Сфингомиелин 0.40 ± 0.04 0.30 ± 0.02 0.40 ± 0.02
Фосфатидилэтаноламин 0.80 ± 0.09 0.70 ± 0.05 0.90 ± 0.07
Лизофосфатидилхолин 0.20 ± 0.01 0.20 ± 0.02 0.20 ± 0.01
Фосфатидилсерин 0.40 ± 0.03 0.20 ± 0.01* 0.20 ± 0.01*
Холестерин/фосфолипид 0.69 0.71 1.00*
Фосфатидилхолин/фосфатидилэтаноламин 0.62 2.00* 1.11*
Фосфатидилхолин/сфингомиелин 1.25 4.60* 2.50*
Примечание. Здесь и далее: контроль - здоровая рыба, содержащаяся на кормах, не вызывающих катаракту; норма - рыба, не имеющая видимой катаракты, но содержащаяся на тех же кормах, что и больная рыба.
* Различия между приведенными в таблицах показателями в сравниваемых вариантах достоверны по отношению к контролю прир > 0.05.
Таблица 2. Содержание липидов в хрусталиках двухлеток здоровой и пораженной катарактой семги
Содержание, %
Липиды от сухого веса от суммы
контроль катаракта контроль катаракта
Общие 2.7 ± 0.30 2.20 ± 0.10
Фосфолипиды 1.1 ± 0.10 0.67 ± 0.07* 40.6 ± 2.2 30.6 ± 1.7*
Триацилглицерины 0.1 ± 0.03 0.07 ± 0.03 2.4 ± 0.2 3.1 ± 0.4
Свободные жирные кислоты 0.10 ± 0.04 0.22 ± 0.03 5.9 ± 0.6 10.2 ± 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.