БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 708-715
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ СУКЦИНАТА НА ИНДУЦИРОВАННОЕ ПЕР ЕКИ СНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС
© 2015 г. Е.В. Гришина, Я.В. Хаустова, А.А. Васильева, Е.И. Маевский
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3 E-mail: grishina_lena@rambler. ru Поступила в p едакцию 09.06.15 г.
Исследовано влияние сукцината и 3-гидроксибутирата на кинетику перекисного окисления липидов, индуцированного ЛТФ-Ре2+-комплексом в изолированных митохондриях печени старых (1,0-1,5 года) и молодых (3 месяца) самцов крыс. С этой целью полярографически регистрировали скорость индуцированного в митохондриях печени крыс перекисного окисления липидов Удол и определяли полувремя максимального потребления кислорода At50, включающее лаг-период и фазу инициации. В отсутствие экзогенного субстрата Удол в митохондриях старых животных была несколько выше, а запуск каскада перекисного окисления липидов происходил значительно раньше, чем у молодых животных. Инкубация интактных митохондрий с 5 мМ сукцината в течение 1 мин снижала Удол на 15 и 35% у молодых и старых животных соответственно, однако только в митохондриях старых животных происходило увеличение At50 на 19%. При окислении 3-гидроксибутирата скорость перекисного окисления липидов в митохондриях молодых животных заметно не менялась, тогда как в митохондриях старых животных она понизилась на 19% вместе с незначительным увеличением At50. Для моделирования возрастной дисфункции изолированные митохондрии повреждали серией циклов замораживания-оттаивания, что приводило к значительному увеличению Удол у обеих возра стных групп. Окисление сукцината во всех случаях снижало Удол в поврежденных митохондриях на 56% по сравнению с Удол в отсутствие субстратов и двукратно увеличивало At50 у молодых животных. Окисление 3-гидроксибутирата не влияло на Удол поврежденных митохондрий обеих возрастных групп, но увеличивало At50 на 48% в митохондриях молодых животных. Таким образом, антиоксидантный эффект окисления сукцината может предотвращать повреждение митохондрий при перекисном окислении липидов и оказывать геропро-текторное действие на стареющие митохондрии. Добавление любого из субстратов к фосфо-липидной эмульсии не влияло на параметры перекисного окисления липидов. Следовательно, антиоксидантный эффект обусловлен процессом окисления самих субстратов в дыхательной цепи, а не прямым взаимодействием их с липидами мембран.
Ключевые слова: Fe2+-индуцированное перекисное окисление липидов, митохондрии печени крыс, эффект сукцината и 3-гидроксибутирата.
Наиболее широко принята теория, что старение является результатом разрушения структур ы и функции живых систем под действием свободных радикалов. Эта теория была впервые предложена в 1956 г. [1] и объясняет механизм многих симптомов старения и различных сердечно-сосудистых заболеваний, иммуносупрес-сии, дисфункции мозга и нейроэндокринной системы, катаракты, рака и т.д. В здоровых организмах физиологический уровень свобод-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, СДГ -сукцинанатдегидрогеназа, ПОЛ - перекисное окисление липидов, МПК - митохондрии печени крыс, 3-ГБ - 3-гидроксибутират.
ных радикалов регулируется балансом про- и антиоксидантных систем. В работе [2] была предложена идея, с помощью которой становится возможным замедлить процесс старения путем предотвращения генерации активных форм кислорода (АФК) в митохондриях при старении.
Сукцинат представляет о собый интер ес как геропротектор [3]. Было показано, что экзогенный сукцинат предотвращает инактивацию сук-цинанатдегидрогеназы (СДГ), вызываемую пе-рекисным окислением липидов (ПОЛ), индуцированным Бе2+ [4,5]. Ингибирование СДГ вызывает генерирование супероксидных радикалов в митохондриях и апоптоз [6]. Перокси-
дальная активность увеличивается, когда цикл К реб са ингибируется малонатом на уровне СДГ [7]. Кроме того, антиоксидантный эффект не-хелатирующих субстратов, таких как сукцинат, полностью аннулируется при кипячении или обработке гомогената цианидом [7]. Активные органические прооксиданты ингибируют потребление кислорода выделенными митохондриями печени крыс (МПК), в частности, окисление 2-оксоглутарата, пирувата и глутамата, тогда как окисление сукцината более устойчиво к этому ингибир ующему эффекту и может способствовать защите липидов мембран митохондрий от ПОЛ [8].
До сих пор антиоксидантные свойства субстратов цикла К ребса изучали в жестких про -оксидантных системах, главным образом, в мембранах митохондрий молодых животных. Более того, в ранних исследованиях интенсивность ПОЛ в митохондриях измеряли путем накопления тиобарбитурат-зависимых продуктов после длительной инкубации в проокси-дантных условиях [4,7,9]. Это позволяет оценить только интегральный выход процесса ПОЛ без регистрации его кинетики. Известно, что тио-барбитурат взаимодействует с большим числом субстратов, которые связаны не только с ПОЛ, что также искажает общие результаты [10]. Мы оценивали антиоксидантный эффект субстр ата по кинетике ПОЛ в выделенных МПК. Процесс ПОЛ был индуцир ован АТФ-Ре2+-комплексом в течение нескольких минут [11]. Мы выбрали негемовое железо как более физиологический прооксидантный агент, так как существуют свидетельства возраст-зависимого накопления не-гемового железа в тканях животных, которое, в свою очер едь, нарушает клеточный гомеостаз и вызывает ряд дисфункций митохондрий, включая активацию ПОЛ [12,13]. Мы использовали тот же индуктор для определения возможного антиоксидантного эффекта субстр ата на ПОЛ в модельной системе фосфолипидной эмульсии. Было показано, что антиоксидантные эффекты субстратов, о собенно сукцинат, более выражены в обеих возрастных группах и наиболее значимы в разрушенных митохондриях. Добавление сукцината продуцирует антиоксидантный эффект путем ингибирования Удол в интактных и поврежденных МПК обеих групп животных в разной степени. Антиоксидантный эффект сукцината более выражен в поврежденных митохондриях молодых животных, в то время как 3-гидроксибутират (3-ГБ) фактически не проявлял антиоксидантного эффекта для МПК обеих групп.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
P еагенты. В опытах были использованы следующие реагенты: сахароза (PRS, Испания), KCl (USB, США), KH2PO4, MgSO4 (ultra-pure reagents, Россия), EG TA, HEPES, трис (Serva, Гер мания), сукцинат (Sigma, США), глютамат (Sigma, США), 3-ГБ (Sigma, США), фосфати-дилхолин (S-100, Германия).
Выделение митохондрий. МПК были выделены из печени крыс самцов линии Sprague Dawley методом дифференциального центр ифу-гирования по стандартной методике [14]. Возраст молодых животных (200-250 г) составлял три месяца, старых животных (400-500 г) -24-30 месяцев. Среда выделения содержала 0,3 М сахарозы, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 1 мМ EGTA. МПК отмывали в ср еде выделения без EGTA. Полученные МПК имели показатель дыхательного контроля более 4,0 при окислении сукцината. Концентрацию белка митохондрий измеряли биуретовым методом.
Приготовление эмульсии фосфолипидов.
Эмульсию 10% фосфатидилхолина в воде готовили с помощью гомогенизатора высокого давления APV-1000 (SPX, Великобритания). Pазмеp частиц эмульсии был определен с использованием N5 Submkron Partide Size Analyzer (Be^ kman ^ulter, США).
Определение активности фосфорилирующего дыхания в митохондриях печени крыс. Дыхание МПК регистрировали полярографически с помощью закрытого кислородного электрода (электрод Кларка) в термостатируемой ячейке объемом 1 мл, при 27°С и постоянном перемешивании. Кинетику потребления кислорода фиксировали с помощью компьютеризированной многоканальной системы «Re^rd 4» (ИБК PАН, Pоccия). Среда инкубации содержала 125 мМ Kd, 3 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 10 мМ HEPES (рН 7,4). Конечная концентрация митохондрий в ячейке составляла 1,5 мг белка/мл. В качестве субстрата окисления использовали 5 мМ сукцинат калия с 1 мМ глутаматом или 8 мМ 3-гидроксибутират (рН 7,3). Было зарегистрировано потребление O2 для различных метаболических состояний митохондрий: скорость V2, которая зависит от утечки протонов и скоро сти окисления экзогенного субстра -та без АДФ; V3 - скорость фосфорилирующего дыхания в присутствии 150 мкМ АДФ; V4 -скорость дыхания после фосфорилирования АДФ в АТФ. Показатель дыхательного контроля оценивали, согласно работе [15], как отношение V3/V4.
Pегистрация кинетики перекисного окисления липидов. ПОЛ индуцировали комплексом
/
Рис. 1. Полярографическая регистрация потребления кислорода во время ПОЛ, индуцированного комплексом АТФ /Ре2+ в суспензии интактных МПК молодых животных (1 мг белка) в среде без суб-страта.
АТФ-Ре2+ в интактных МПК или поврежденных органеллах после цикла замораживания-оттаивания. Часть изолированных МПК была замо р ожена пр и -20°С. Оттаивали МПК непо-ср едственно пер ед измер ением ПОЛ. Мы р ас-считывали стадию инициации ПОЛ (ср азу после добавления комплекса АТФ -Ре2+) и скор о сть фактического ПОЛ [11,16]. Этот метод реги ст -рации отличается от традиционного метода хе-милюминесценции и определения концентрации малонового диальдегида, в котор ы х измер яется только интегр альный выход ПОЛ. Это классический подход, котор ый шир око используется для изучения пер екисного окисления липидов. Многие автор ы показали, что накопление тио-барбитурат-зависимых продуктов во время ПОЛ соответствует количеству потребляемого кислорода в результате Ре2+-индуцированного ПОЛ [17-20]. Добавление комплекса АТФ -Ре2+ к инкубир ованным пр и рН 7,4 митохондр иям печени кр ы с изначально сопр овождалось медленным потреблением кислорода, но после ини-цииации каскада ПОЛ р асход кислор ода повышался (р ис. 1). Инициация ПОЛ пр оисходит, когда соотношение Ре2+/Ре3+ становится равным 1:1 в течение лаг-периода [16,21].
Среда инкубации пр и регистр ации ПОЛ со -дер жала 175 мМ КС1 и 10 мМ тр ис-НС1-буфер а (рН 7,4). Суспензию МПК (1 мг/мл) инкубир о -вали в течение 1 мин в среде инкубации без суб стр ата, в пр исутствии 5 мМ сукцината калия (флавинадениндинуклео
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.