ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2014, том 88, № 3, с. 538-544
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 535.372.3; 538.958
ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА, ДЕНАТУРИРОВАННОГО ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ, ПО ДАННЫМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТРИПТОФАНА © 2014 г. И. М. Власова, В. В. Журавлева, А. М. Салецкий
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет
E-mail: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 15.05.2013 г.
Исследована вращательная диффузия молекул БСА в растворах с различными концентрациями анионного детергента ДСН при различных значениях pH, на основании чего получена информация о денатурации БСА под действием ДСН. По увеличению степени поляризации триптофановой флуоресценции БСА и по полученным параметрам вращательной диффузии молекул БСА зарегистрирован двустадийный характер денатурации БСА под действием ДСН при значениях pH < pI БСА (4.9) и одностадийный характер денатурации БСА под действием ДСН при значениях pH > pI БСА. Показано, что первая стадия денатурации БСА, общая для всех значений pH, — разрыхление глобул БСА, вторая стадия денатурации БСА, происходящая при pH < pI БСА, — разворачивание аминокислотной цепи белка. Сделан вывод, что более глубокая денатурация БСА под действием ДСН имеет место при значениях pH < pI БСА.
Ключевые слова: бычий сывороточный альбумин, денатурация, додецилсульфат натрия, триптофа-новая флуоресценция, вращательная диффузия.
Б01: 10.7868/8004445371403025Х
Бычий сывороточный альбумин (64 кДа) представляет собой глобулярный белок плазмы крови. Уникальная способность молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА) связывать обширный круг органических и неорганических лиган-дов определяет одну из основных функций этого белка — транспорт физиологических метаболитов. Основой взаимодействий молекулы БСА с лигандами является структурная подвижность этой белковой молекулы, обеспеченная уникальной петлевой укладкой полипептидной цепи белка из 582 аминокислотных остатков [1]. Вторичная структура БСА состоит из а-спиральных участков и участков хаотической укладки при физиологическом значении рН, тогда как содержание в-складчатых структур крайне незначительно. Третичная структура БСА определяется тремя доменами.
Таким образом, БСА является типичным представителем гомологичного семейства сывороточных альбуминов. Уровни структурной организации БСА практически идентичны уровням структурной организации сывороточного альбумина человека (САЧ) [1]. БСА и САЧ практически гомологичны и отличаются лишь некоторыми аминокислотными остатками. В частности, САЧ содержит один остаток триптофана Тгр 214, а БСА содержит два остатка триптофана — Тгр 135 и Тгр 214.
Выбор БСА в данной работе как модельного белка обусловлен важной ролью этого белка в плазме крови, определяемой широким разнообразием функций этого белка: альбумин обеспечивает коллоидно-осмотическое давление крови, регулирует вместе с другими белками плазмы рН крови и служит переносчиком различных метаболитов.
Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, что обуславливает интерес к изучению механизмов белковой денатурации.
Денатурация белков может быть вызвана действием ряда факторов [2]. Например, повышение температуры приводит к тепловой денатурации. Также денатурации способствует воздействие на белок реагентов, нарушающих нековалентные взаимодействия, прежде всего систему водородных связей, — например, концентрированных растворов мочевины (6—8 М).
Денатурирующим действием на белки обладают и органические растворители. Они способны устанавливать контакты с гидрофобными аминокислотными остатками белка, лишая гидрофобное ядро его стабилизирующей роли. Одновре-
менно многие растворители, например, спирты, как бы переключают на себя водородные связи, поддерживающие третичную структуру.
Денатурация белков может происходить и при экстремальных значениях рН. В сильнокислых растворах (при рН ниже 2) полностью протониру-ются отрицательно заряженные карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Это приводит к тому, что на поверхности белка сохраняются только положительные заряды катионных групп, взаимное отталкивание которых приводит к развертыванию глобул. В щелочных растворах (при рН 11 и выше) утрачиваются положительные заряды аминогруппы лизина и приобретают отрицательные заряды фе-нольные группы тирозина, что ведет к резкому преобладанию отрицательных зарядов и развертыванию глобул белка [2].
Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты [2]. Детергенты представляют собой органические амфифильные соединения, молекулы которых имеют гидрофильные и гидрофобные участки. По типу гидрофильных групп различают несколько типов детергентов — ионные и неионные. Ионные детергенты диссоциируют в растворе на ионы, одни из которых поверхностно активны, а другие (проти-воионы) — нет. В зависимости от знака заряда поверхностно-активного иона ионные детергенты делят на анионные, катионные и амфотерные [3, 4].
Основную долю в фармацевтических, медицинских и биохимических исследованиях составляют ионные детергенты, обладающие денатурирующими свойствами, такие как анионный детергент додецилсульфат натрия ДСН (критическая концентрация мицеллообразования ККМ 8.2 мМ по [4, 5]), применяющийся при электрофорезе белков в полиакриламидном геле для определения их массы.
Ранее нами спектроскопически была изучена денатурация БСА под действием катионного детергента цетилтриметиламмонийбромида ЦТАБ [6, 7], также была исследована денатурация САЧ под действием ЦТАБ [8—10]. Денатурирующее же действие анионного детергента ДСН на белки нами ранее спектроскопическими методами было изучено на примере САЧ [11—14].
Представляет интерес исследовать денатурацию БСА под действием ДСН по анализу параметров вращательной диффузии молекул БСА в растворах с различными концентрациями ДСН, полученными по изучению поляризованной триптофановой флуоресценции БСА с учетом формулы Левшина— Перрена [15—17] по разработанной нами методике для биологических белковых систем [10, 18]. Исследование триптофановой собственной флуоресценции белков широко применяется для оценки структурного состояния белковых молекул и для анализа их взаимодействия с различны-
ми лигандами, в том числе денатурирующими, [6, 7, 9, 10, 13, 14, 19—23], так как флуоресцентные свойства триптофановых остатков в молекулах белков весьма чувствительны к перестройкам белковых глобул.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растворы БСА (Sigma) получены путем разведения белка до концентрации 5 мкМ в двух различных буферных системах: 0.1 М CH3COOH — KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2PO4 - 0.1 М NaOH (pH 5.5-8.0). В растворы БСА при различных значениях pH (3.5-8.0) добавлены различные концентрации ДСН (0.5-7.0 мМ). Для анализа вращательной диффузии молекул БСА для вариации вязкости в итоговые растворы добавлены различные концентрации сахарозы (0-200 мМ).
Флуоресцентные исследования проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS55, спектрально-флуоресцентные характеристики приготовленных образцов исследовались при комнатной температуре. Измерения флуоресценции образцов БСА проводились через фиксированный интервал времени после добавления в них ДСН.
Триптофановая флуоресценция БСА регистрировалась в диапазоне 300-500 нм при возбуждении светом с длиной волны ^возб = 295 нм. Степень поляризации P триптофановой флуоресценции БСА рассчитывалась по значениям I и /± в максимуме спектра испускания флуоресценции белка, где I и /± - интенсивности свечений, поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Спектры флуоресценции обрабатывались программой Perkin Elmer FL Winlab.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В работе проведены исследования поляризованной триптофановой флуоресценции БСА. Получены зависимости степени поляризации триптофановой флуоресценции БСА (Р) от концентрации ДСН для различных значений рН (рис. 1). Значения Р рассчитывались по значениям Ц и /± в максимуме спектров испускания флуоресценции БСА.
Как известно, изменения поляризации флуоресценции обуславливаются двумя причинами — во-первых, вращательной диффузией флуорофо-ров и, во-вторых, безызлучательным переносом энергии между флуорофорами. Благодаря подбору экспериментальных условий (исследованы сильно разбавленные растворы белка (5 мкМ)) вклад от второй причины — безызлучательного переноса энергии между флуорофорами — отсутствует.
Рис. 1. Зависимости степени поляризации (Р) триптофановой флуоресценции БСА (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН: 3.5 (1), 4.0 (2), 4.5 (3), 5.0 (4), 5.5 (5), 6.0 (б), 6.5 (7), 7.0 (8), 7.5 (9), 8.0 (10).
Таким образом, при данных экспериментальных условиях на поляризацию триптофановой флуоресценции БСА оказывает влияние только вращательная диффузия флуорофоров — трипто-фановых остатков молекулы БСА. Эта поляризация флуоресценции триптофановых остатков молекулы БСА в общем случае обусловлена как вращением целой молекулы белка (броуновское диффузионное движение), так и вращением доменов БСА, содержащих триптофановые остатки, так и вращением самих триптофанов относительно их ближайшего окружения. Проведенные в данной работе измерения поляризованной стационарной флуоресценции БСА позволяют ана-
ДР/Д[ДСН], мМ-1
рН
Рис. 2. Среднее изменение степени поляризации Р триптофановой флуоресценции БСА к изменению концентрации ДСН в растворах с различными значениями рН.
лизировать вращение целой молекулы белка, а вклад вращения доменов, содержащих триптофа-новые остатки, и вращения триптофановых остатков относительно ближайшего окружения считается пренебрежимо малым.
Как видно из рис. 1, значения Р возрастают в области до 1 мМ ДСН для всех значений рН, что указывает на первую стадию денатурации БСА — разрыхление глобул.
Дальнейшее увеличение (больше 1 мМ) концентрации ДСН при рН, больших изоэлектриче-ской точки БСА р1 (4.9), практически не меняет значений Р (рис. 1), что указывает на то, что денатурация останавливается на первой стадии.
Иной характер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.