научная статья по теме ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПО ДАННЫМ ПОЛЯРИЗОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Химия

Текст научной статьи на тему «ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПО ДАННЫМ ПОЛЯРИЗОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ»

ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 89, № 2, с. 345-350

БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

УДК 535.372.3;538.958

ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПО ДАННЫМ ПОЛЯРИЗОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ © 2015 г. И. М. Власова, А. А. Кулешова, А. А. Власов, А. М. Салецкий

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет

E-mail: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 16.04.2014 г.

Исследована поляризованная флуоресценция и вращательная диффузия маркеров семейства флуо-ресцеина (исходного соединения флуоресцеина и его галоген-производных — эритрозина, эозина и бенгальского розового) в растворах бычьего сывороточного альбумина (БСА). В растворах БСА обнаружено увеличение степени поляризации флуоресценции маркеров, увеличение времени вращательной релаксации и уменьшение коэффициента вращательной диффузии маркеров. Показано, что для регистрации факта связывания с БСА подходят все четыре маркера семейства флуоресцеина, но для исследований БСА при вариации значений pH больше подходит флуоресцеин, содержащий в структурной формуле слабо электроотрицательные атомы водорода. Обнаружено, что увеличение электроотрицательности атомов в структурных формулах маркеров приводит к увеличению степени поляризации их флуоресценции, к уменьшению коэффициента их вращательной диффузии и к увеличению времени их вращательной релаксации.

Ключевые слова: бычий сывороточный альбумин, флуоресцентные маркеры, флуоресцеин, эритро-зин, эозин, бенгальский розовый, вращательная диффузия.

Б01: 10.7868/80044453715020363

Бычий сывороточный альбумин (БСА, 64 кДа, изоэлектрическая точка р1 4.9) представляет собой глобулярный белок плазмы крови. Уникальная способность молекулы БСА связывать обширный круг органических и неорганических ли-гандов определяет одну из основных функций этого белка — транспорт физиологических метаболитов. Основой взаимодействий молекулы БСА с лигандами является структурная подвижность этой белковой молекулы, обеспеченная уникальной укладкой цепи белка. Первичная структура БСА определяется единственной полипептидной цепью, состоящей из 582 аминокислотных остатков. Вторичная структура БСА состоит из а-спиральных участков и участков хаотической укладки при физиологическом значении рН, тогда как содержание Р-складчатых структур крайне незначительно. Третичная структура БСА определяется тремя доменами.

БСА является типичным представителем гомологичного семейства сывороточных альбуминов и имеет строение, схожее с сывороточным альбумином человека (САЧ), с небольшими различиями [1—3]. БСА и САЧ практически гомологичны и отличаются лишь некоторыми аминокислотными остатками. В частности, САЧ содержит один остаток триптофана Тгр 214, а БСА

содержит два остатка триптофана — Тгр 135 и Тгр 214.

В плазме крови функции сывороточных альбуминов разнообразны: альбумин обеспечивает коллоидно-осмотическое давление крови, регулирует вместе с другими белками плазмы рН крови и, главное, служит переносчиком различных метаболитов и лекарственных препаратов.

Механизм связывания лигандов с молекулой БСА определяется наличием на белке специфических участков — связывающих центров. Некоторые реакции связывания белка с лигандами обеспечиваются электростатическими взаимодействиями, другие — носят ковалентный характер, вызывая химические модификации боковых радикалов аминокислотных остатков.

Большую роль в изучении физико-химических свойств связывающих центров БСА играет метод флуоресцентных маркеров [3—7]. Для исследования БСА, как и САЧ, непосредственно в плазме крови используют анионные при физиологическом значении рН (7.4) маркеры семейства флуоресцеина — исходное соединение флуоресцеин и его галоген — производные (тетра-йод-производ-ная — эритрозин, тетра-бром-производная — эозин, тетра-хлор-тетра-йод-производная — бенгальский розовый). Флуоресцентные маркеры се-

P 0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

3

9

pH

Рис. 1. Зависимости от рН степени поляризации флуоресценции маркеров: 3 мкМ флуоресцеина (1, 2), 30 мкМ эритрозина (3, 4), 30 мкМ эозина (5, 6) и 3 мкМ бенгальского розового (7, 8) в растворах без белка (1, 3, 5, 7) и в растворах 150 мкМ БСА (2, 4, 6, 8).

мейства флуоресцеина используются для моделирования взаимодействия лекарственных препаратов с БСА.

Ранее нами изучены процессы молекулярной ассоциации маркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ [8—11], флуоресценция (как непо-ляризованная, так и поляризованная) маркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ [9—13], исследованы механизмы связывания маркеров семейства флуоресцеина с САЧ [14—18]. Также нами изучены процессы молекулярной ассоциации маркеров семейства флуоресцеина и их непо-ляризованная флуоресценция в растворах БСА, исследованы механизмы связывания маркеров семейства флуоресцеина с БСА [19, 20].

Представляет интерес исследование поляризованной флуоресценции маркеров и определение параметров вращательной диффузии маркеров семейства флуоресцеина в растворах БСА при различных значениях рН, что и является целью данной работы. В данной работе параметры вращательной диффузии маркеров семейства флуоресцеина в растворах БСА определены по анализу поляризованной флуоресценции маркеров в растворах белка с учетом формулы Левшина—Перрена [4, 21, 22] по использованной нами ранее методике для биологических белковых систем [23—26].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

На основе подготовленных буферных растворов: 0.1 М CH3COOH - KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2PO4 - 0.1 М NaOH (pH 6.0-8.0) приготовлены растворы (pH 3.5-8.0) соответствующего 30 мкМ маркера (флуоресцеина, эритрозина, эозина, бенгальского розового) как без белка, так и содержащие 150 мкМ БСА (Sigma), в которые для анализа вращательной диффузии маркеров в растворах для вариации вязкости были добавлены различные концентрации сахарозы (0-200 мМ).

Флуоресцентные исследования проводились на спектрофлуориметре Perkin ElmerLS55, спектрально-флуоресцентные характеристики образцов исследовались при комнатной температуре. Измерения флуоресценции образцов проводились через фиксированный интервал времени после добавления всех компонентов.

Флуоресценция маркеров в исследуемых растворах возбуждалась светом со следующими длинами волн: 1) флуоресцеин - ^фо"зб = 440 нм; 2) эритрозин - X во™ = 530 нм; 3) эозин - = 520 нм; 4) бенгальский розовый - ^^ = 540 нм.

Степень поляризации P флуоресценции маркеров в растворах рассчитывалась по значениям I \ \ и I± в максимуме спектров испускания флуоресценции маркеров, где I \ \ и I± - интенсивности свечений, поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Спектры флуоресценции маркеров обрабатывались программой Perkin Elmer FL Winlab.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для анализа связывания маркеров семейства флуоресцеина с БСА получены спектры поляризованной флуоресценции маркеров в растворах с БСА при различных значениях pH.

Для оценки влияния БСА на поляризацию флуоресценции маркеров (флуоресцеина, эритрозина, эозина и бенгальского розового) проведен сравнительный анализ степени поляризации флуоресценции (P) маркеров при различных значениях pH, как в растворах без белка, так и в растворах с БСА (рис. 1). Степень поляризации флуоресценции маркеров в растворах рассчитывалась по значениям I\ \ и I± в максимуме спектров испускания их флуоресценции.

Видно, что степень поляризации P флуоресценции всех четырех маркеров семейства флуоресцеина в растворах с БСА больше, чем в растворах без белка, что объясняется их связыванием с белком.

При этом наблюдаются различия между флуо-ресцеином и его галоген-производными в зависимостях степени поляризации флуоресценции P от pH.

6

4

5

7

8

ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ

347

Как в растворах без белка, так и в растворах БСА, степень поляризации P флуоресценции флуоресцеина нелинейно зависит от pH с максимумом при pH 6.0. При наличии слабо электроотрицательных атомов водорода в структурной формуле флуоресцеина основное влияние на вращательную диффузию маркера оказывают процессы ионизации флуоресцеина, определяемые значениями его pK, и процессы его молекулярной ассоциации, что приводит, в свою очередь, к нелинейному виду зависимости поляризации флуоресценции маркера от pH.

Тогда как степень поляризации P флуоресценции галоген-производных флуоресцеина (эритро-зина, эозина и бенгальского розового) не зависит от pH (в диапазоне 3.5 < pH < 8.0), как в растворах БСА, так и в растворах без белка, что объясняется наличием в молекулах этих маркеров сильно электроотрицательных атомов (брома, йода, хлора), затрудняющих изменения вращательной диффузии маркеров при вариации значений pH.

Как в растворах без белка, так и в растворах с БСА наблюдается зависимость величины степени поляризации флуоресценции маркеров от электроотрицательности атомов в их структурных формулах. По мере увеличения электроотрицательности атомов в формулах маркеров значение степени поляризации их флуоресценции возрастает и в растворах без белка, и в растворах с БСА. Степень поляризации флуоресценции маркеров возрастает в ряду флуоресцеин — эритрозин — эозин — бенгальский розовый.

При сравнении значений степени поляризации флуоресценции маркеров в растворах БСА, полученных в ходе данных исследований, и в растворах САЧ, полученных нами ранее, следует отметить, что в растворах с БСА по сравнению с растворами с САЧ степень поляризации флуоресценции маркеров незначительно меньше.

Метод поляризованной флуоресценции позволяет оценивать параметры вращательной диффузии флуорофоров. Количественная теория вращательной деполяризации была предложена В.Л. Левшиным и Ф. Перреном с использованием модели вращательной диффузии. На основе этой теории было получено выражение для степени поляризации P флуоресценции:

1 = 1 +

1 _ 1 ] kiio 3,

P Po IP V ¥ц где T — абсолютная температура, n — вязкость раствора, V — объем, к — постоянная Больцмана, т0 — среднее время жизни возбужденных молекул, P0 — предельная степень поляризации флуоресценции.

Данная зависимость получила название формулы Левшина—Перрена. Таким образом меняя ли

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»