научная статья по теме ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА Химия

Текст научной статьи на тему «ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА»

ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2011, том 85, № 5, с. 964-969

БИОФИЗИЧЕСКАЯ ^^^^^^^^^^^^ ХИМИЯ

УДК 535.372.3; 538.958

ВРАЩАТЕЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ МАРКЕРОВ СЕМЕЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕИНА В РАСТВОРАХ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА © 2011 г. И. М. Власова, Е. М. Бухарова, А. М. Салецкий

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический факультет

E-mail: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 20.03.2010 г.

Исследована вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина (исходного соединения флуоресцеина и его галогенпроизводных — эозина и эритрозина) в растворах сывороточного альбумина человека (САЧ) при различных значениях pH. Установлено, что в растворах САЧ степень поляризации флуоресценции, время вращательной релаксации и эффективный радиус Эйнштейна наномаркеров больше, а коэффициент вращательной диффузии наномаркеров меньше, чем в растворах без белка. Сделан вывод, что увеличение электроотрицательности атомов в структурных формулах наномаркеров приводит к увеличению степени поляризации их флуоресценции, к уменьшению коэффициента их вращательной диффузии, к увеличению времени их вращательной релаксации, к увеличению эффективного радиуса Эйнштейна.

Ключевые слова: сывороточный альбумин человека, вращательная диффузия, наномаркеры, флуоресценция.

Сывороточный альбумин (66.4 кДа, изоэлек-трическая точка р/ = 4.7) — белок плазмы крови человека. Уникальное свойство сывороточного альбумина человека (САЧ) связывать обширный круг лигандов определяет главную функцию этого белка — транспорт физиологических метаболитов и некоторых лекарственных препаратов в кровотоке. Механизм связывания лигандов с САЧ определяется наличием на белке связывающих центров [1].

Большую роль в изучении физико-химических свойств связывающих центров САЧ (в частности, непосредственно в плазме крови) играет метод флуоресцентных наномаркеров, являющихся низкомолекулярными лигандами для САЧ [2—5]. Для исследования САЧ в плазме крови используют анионные при физиологическом значении рН наномаркеры, такие как наномаркеры семейства флуоресцеина. К семейству флуоресцеина относятся исходное соединение флуоресцеин, его бром-производное — эозин и его йодпроизводное — эритрозин.

Исследования механизмов связывания флуоресцентных наномаркеров семейства флуоресцеина с САЧ [6—8] позволяют получать информацию о строении и свойствах связывающих центров, в том числе лекарственных сайтов, САЧ, что имеет важный прикладной медицинский и фармакологический аспект в связи с тем, что многие лекарственные препараты переносятся в кровотоке в связанном с САЧ виде.

Для практического использования наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ представляет интерес исследование параметров вращательной диффузии данных наномаркеров в растворах САЧ при различных значениях pH, что и является целью данной работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали следующие буферные растворы: 0.1 М CH3COOH—KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2P04-0.1 М NaOH (pH 6.0-8.0). На их основе были приготовлены растворы соответствующего 30 мкМ наномаркера (флуоресцеина, эозина, эритрозина) как без белка, так и содержащие 150 мкМ САЧ, с добавлением различных концентраций сахарозы (0, 10, 50, 100, 150, 200 мМ) при различных значениях pH (3.5-8.0).

Исследования флуоресценции наномаркеров в растворах САЧ проводились с помощью спек-трофлуориметра LS 55 (Perkin Elmer) при температуре ~20°С. Флуоресценция наномаркеров в исследуемых растворах возбуждалась светом со следующими длинами волн: 1) флуоресцеин -

^возб = 440 нм; 2) эозин - = 520 нм; 3) эритро-

зин - Щ = 530 нм.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для анализа связывания наномаркеров семейства флуоресцеина с САЧ получены спектры флу-

оресценции наномаркеров при различных значениях pH. Проведен сравнительный анализ интенсивности в максимуме спектра неполяризованной

флуоресценции наномаркера (Т^Г) при различных pH в растворах, как без белка, так и с САЧ. В растворах с САЧ вследствие связывания с белком происходит тушение флуоресценции наномаркеров по сравнению с растворами без белка. При различных значениях pH получена разность

л /max /max г г /max

АУфл , равная 1фл в растворах без белка минус 1фл в растворах САЧ, и отражающая связывание наномаркера с САЧ (рис. 1).

Следует отметить, что для всех трех наномар-керов в растворах с САЧ максимум спектра флуоресценции (^) смещается в красную область по сравнению с растворами без белка. Например, у флуоресцеина при pH 5.0 в растворах без белка

л max г1л а тт л max

Лфл = 510 нм, а в растворах с САЧ величина Лфл = = 515 нм. У эритрозина при pH 5.0 в растворах без

белка Аф" = 550 нм, в растворах с САЧ значение

= 566 нм. У эозина при pH 5.0 в растворах без

белка = 544 нм, в растворах с САЧ величина

= 560 нм.

Флуоресцеин в зависимости от pH находится в следующих формах. При значениях pH до 5.5 молекулы флуоресцеина находятся в слабо положительно заряженной форме. При значениях pH 5.5—6.8 молекулы флуоресцеина электрически нейтральны. Для флуоресцеина значение pZ(OH) = 6.8. В области pH 6.8—8.0 молекулы флуоресцеина слабо отрицательно заряжены и находятся в форме моноанионов. Значение p^(COOH) флуоресцеина — 8.0. При pH > 8.0 молекулы флуоресцеи-на заряжены отрицательно и находятся в форме

дианионов. Судя по значению АТ^1™, показывающему величину тушения флуоресценции флуоресцеина в растворах САЧ по сравнению с растворами без белка, наибольшее связывание флуоресцеина с САЧ происходит при pH 5.0—6.0, т.е. когда молекулы флуоресцеина либо заряжены слабо положительно (pH 5.0—5.5) либо электрически нейтральны (pH 5.5—6.0), а САЧ заряжен слабо отрицательно (pi = 4.7). При этом максимальная молекулярная ассоциация флуоресцеина [7], как в белковых растворах, так и в растворах без белка, имеет место при pH 6.0, когда молекулы наномар-кера электрически нейтральны.

Для эритрозина получены следующие значения pK ионизируемых групп: pK(OH) = 3.6 и pK(COOH) = 5.5. В области значений pH < 3.6 молекулы эритрозина электрически нейтральны. В случае pH 3.6—5.5 молекулы эритрозина заряжены слабо отрицательно (моноанионы). При pH > 5.5 молекулы эритрозина сильно отрицательно заря-

Д!флтах, отн.ед. 400

300

200 -

100 -

4

6

8 pH

Рис. 1. Разность интенсивностей в максимуме спектров флуоресценции наномаркеров (Л/ф^) в растворах САЧ, для наномаркеров семейства флуоресцеина при различных значениях рН: 1 — флуоресцеин, 2 — эритрозин, 3 — эозин.

жены (дианионы). Судя по значению Д/фГ, характеризующему величину тушения флуоресценции эритрозина в растворах САЧ, наибольшее связывание его с САЧ происходит при значениях рН, меньших ~5.0 т.е. когда эритрозин либо является моноанионом (рН 3.6—5.0) либо электрически нейтрален (рН 3.5—3.6), а САЧ положительно заряжен (при рН, меньших р/ = 4.7). При этом с ростом рН происходит ослабление молекулярной ассоциации [7] эритрозина.

Эозин в зависимости от рН находится в следующих формах. При значениях рН, меньших 3.0 молекулы эозина электрически нейтральны. Значение р^(ОН) эозина ~3.0. При 5.0 > рН > 3.0 молекулы эозина заряжены слабо отрицательно (моноанионы). Значение р^(СООН) эозина ~5.0. При рН > 5.0 эозин заряжен сильно отрицательно

(дианион). Судя по значению Д/фГ, отражающему величину тушения флуоресценции эозина в растворах САЧ по сравнению с растворами без белка, наибольшее связывание его с САЧ происходит при значениях рН, меньших ~5.0, когда эозин является моноанионом (рН 3.5—5.0), а САЧ положительно заряжен (при рН, меньших р/ = = 4.7). При этом с ростом значений рН происходит ослабление молекулярной ассоциации [7] эозина.

Интересно сравнить описанные выше результаты неполяризованной флуоресценции наномарке-ров с исследованием поляризованной флуорес-

0

P 0.4

0.3

0.2

0.1

-о-

4

6

8 pH

теории получено выражение для степени поляризации Р флуоресценции:

1 = 1 + (1 -1 ^ Та

Р Р0 3J Гц ,

где Т — абсолютная температура, п — вязкость раствора, V — объем, к — постоянная Больцмана, т0 — среднее время жизни возбужденных молекул, Р0 — предельная степень поляризации флуоресценции.

Данная зависимость получила название формулы Левшина—Перрена. Таким образом меняя либо вязкость растворов, либо их температуру, и откладывая на оси ординат 1/Р, а по оси абсцисс Т/п получаем прямую линию, которая отсекает на оси ординат отрезок, равный 1/Р0.

Тангенс угла наклона этой прямой к оси абсцисс

Рис. 2. Степень поляризации (P) флуоресценции 30 мкМ флуоресцеина (1, 2), 30 мкМ эритрозина (3, 4), 30 мкМ эозина (5, 6) в растворах без белка (1, 3, 5) и в растворах 150 мкМ сывороточного альбумина человека (2, 4, 6) при различных значениях pH.

ценции наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах с САЧ при различных значениях pH.

Как в растворах с САЧ, так и в растворах без белка, определена степень поляризации (P) флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеи-на (рис. 2) при различных значениях pH, рассчитанная по значениям I\ \ и I± в максимуме спектров испускания их флуоресценции. Показано (рис. 2), что при всех значениях pH степень поляризации флуоресценции наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах САЧ больше, чем в растворах без белка.

Зависимости степени поляризации флуоресценции от pH различаются для флуоресцеина и его га-логенпроизводных (эозина и эритрозина). Как в растворах с САЧ, так и в растворах без белка, у флуоресцеина зависимости степени поляризации флуоресценции от pH имеют нелинейный вид с максимумом при pH 6.0, а у эозина и эритрозина они от pH не зависят (в диапазоне 3.5 < pH < 8.0).

Поскольку растворы наномаркеров исследуемых концентраций являются разбавленными растворами, то в отсутствие безызлучательного переноса энергии между молекулами наномаркеров основной причиной деполяризации флуоресценции является вращательная диффузия молекул наномаркера.

Метод поляризованной флуоресценции позволяет оценивать параметры вращательной диффузии флуорофоров [9—11]. Количественная теория вращательной деполяризации была предложена В.Л. Левшиным и Ф. Перреном с использованием модели вращательной диффузии. На основе этой

tg9

1 1 ï кт

31 V

при извес

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком