ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 228-235
= БИОХИМИЯ =
УДК 619.611.573.616:092.632.636.578:582.29
ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБОВ (МИКОТОКСИНЫ) В ЛИШАЙНИКАХ РАЗНОЙ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
© 2014 г. А. А. Буркин, Г. П. Кононенко
Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН, 123022 Москва, Звенигородское ш., 5 E-mail: vniivshe@mail.ru Поступила в редакцию 05.08.2013 г.
С помощью иммуноферментного анализа определены вторичные грибные метаболиты (микоток-сины) в лишайниках 22 видов семейств Parmeliaceae, Nephromataceae, Umbilicariaceae, Ramalinaceae, Cladoniaceae, Peltigeraceae и Teloschistaceae. Показано присутствие в них в широких диапазонах с частотой 70—100% стеригматоцистина (7—2090 нг/г), альтернариола (20—6460 нг/г) и эмодина (45—94500 нг/г). Установлено, что микофеноловая кислота имела частую встречаемость в 19, цит-ринин — в 17, диацетоксисцирпенол — в 11, циклопиазоновая кислота — в 10 и зеараленон — в 9 видах; PR-токсин был регулярным компонентом у трех видов лишайников, дезоксиниваленол, фумо-низины и охратоксин А — у двух, Т-2-токсин и эргоалкалоиды — у одного; афлатоксин Bj был обнаружен только в шести видах с частотой от 2 до 42%, а роридин А — в 10% образцов Hypogymnia physodes.
DOI: 10.7868/S0002332914030047
Изучение минорных метаболитов в лишайниках — сложная научная проблема, поскольку в этих организмах биохимический фон представлен многообразием собственных веществ, содержащихся в значительных количествах и известных под общим названием "хемосиндром" (Elix, 1996). Однако в настоящее время эта проблема успешно решается с помощью иммунохимиче-ских методов, сочетающих высокую селективность, точность и чувствительность. Так, иммуно-ферментный анализ (ИФА) был применен для определения в лишайниках абсцизовой кислоты (гормонального регулятора стрессовых состояний) в количествах, равных единицам и тысячам пкмоль/г (Deitz, Härtung, 1998). С помощью ИФА удалось показать присутствие в этих организмах микотоксинов в количествах от десятитысячных до сотых долей процента (Буркин, Кононенко, 2010, 2011; Кононенко и др., 2012).
Цель работы — изучение особенностей компонентного состава и содержания микотоксинов в лишайниках разной таксономической принадлежности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на 891 образце 22 видов лишайников, относящихся к 7 семействам (табл. 1). Образцы были собраны с разных субстратов летом 2010—2012 гг. на территориях европейской части России, в Сибири и на Дальнем Востоке (Республики Карелия, Коми, Якутия,
Красноярский и Приморский края, Мурманская, Ленинградская, Московская, Владимирская, Тверская, Тюменская, Амурская, Астраханская, Камчатская области), а также получены из Норвегии, Швеции, Финляндии и Турции. Сборы очищали от остатков других растений, почвы или коры, помещали в бумажные пакеты и хранили в воздушно-сухом состоянии до начала исследования. Видовая принадлежность лишайников определялась стандартными методами (Окснер, 1974).
Слоевища лишайника или фрагменты слоевищ взвешивали и помещали в пробирку, после чего добавляли в нее смесь ацетонитрила и воды, 84 : 16. Соотношение навески материала и объема экстрагента равнялось 1 : 10 (вес/объем). Пробирку интенсивно встряхивали и оставляли на 12—14 ч. После повторного встряхивания экстракты разбавляли в 10 раз фосфатно-солевым буфером, содержавшим Туееп 20, и использовали для непрямого конкурентного ИФА. Количественное определение афлатоксина В1 (АВ1), Т-2-токсина (Т-2), эргоалкалоидов (ЭА), стеригматоцистина (СТЕ), охратоксина А (ОА), роридина А (РоА), микофе-ноловой кислоты (МФК), цитринина (ЦИТ), альтернариола (АОЛ), зеараленона (ЗЕН), дезок-синиваленола (ДОН), эмодина (ЭМО), фумони-зинов (ФУМ), диацетоксисцирпенола (ДАС), циклопиазоновой кислоты (ЦПК), РЯ-токсина (РЯ) выполняли с помощью наборов коммерческих иммунореагентов и калибрантов, предназначенных для микотоксикологического контроля объектов растительного происхождения (Буркин,
Таблица 1. Таксономическая принадлежность исследованных лишайников
Семейство Вид Число образцов
Cladoniaceae Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg. 48
C. sulphurina (Michx.) Fr. 30
Nephromataceae Nephroma arcticum (L.) Torss. 42
Parmeliaceae Alectoria sarmentosa (Ach.) Ach. 26
Arctoparmelia centrifuga (L.) Hale 19
Bryoria capillaris (Ach.) Brodo et D. Hawksw. 20
Cetraria islandica (L.) Ach. 95
Flavocetraria nivalis (L.) Randl. et Saag 52
Evernia prunastri (L.) Ach. 53
Hypogymnia physodes (L.) Nyl. 112
Letharia vulpina (L.) Hue. 9
Melanelia hepatizon (Ach.) Thell. 14
Melanohalea olivacea (DeNot.) O. Blanco et al. 30
Parmelia sulcata Taylor 56
Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf. 14
Usnea dasypoga (Ach.) Nyl. 20
Vulpicidapinastri (Scop.) J.-E. Mattson et M.J. Lai 27
Peltigeraceae Peltigera aphthosa (L.) Willd. 36
P. canina (L.) Willd. 34
Ramalinaceae Ramalina farinacea (L.) Ach. 18
Teloschistaceae Xanthoriaparietina (L.) Th. Fr. 114
Umbilicariaceae Umbilicaria hyperborea (Ach.) Hoffm. 22
Кононенко, 2011). Нижние пределы определения микотоксинов в воздушно-сухом материале слоевищ составили 2 (АВ1, Т-2, ЭА), 4 (СТЕ), 8 (ОА, РоА), 20 (МФК, ЦИТ, АО Л, ЗЕН), 40 (ДОН, ЭМО), 50 (ФУМ) и 100 нг/г (ДАС, ЦПК, PR). Точность ИФА была ранее подтверждена экспериментально (Кононенко и др., 1999, 2000; Кононенко, Буркин, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Группу микотоксинов (АВ1, Т-2, ЭА, СТЕ, ОА, РоА) можно было анализировать с наибольшей чувствительностью (2—8 нг/г). Это предполагало их наиболее вероятное обнаружение. Однако только один из них — СТЕ — был найден в каждом из видов лишайников и отмечен как регулярно встречающийся компонент (в 75—100% исследованных образцов) в широком диапазоне (7—2090 нг/г) (табл. 2, 3). Усредненные значения его накопления достигали у Nephroma arcticum 480, а у Vulpici-da pinastri — 395 нг/г. РоА оказался крайне редким в лишайниках и был найден лишь в 10% образцов
Hypogymnia physodes (10—40 нг/г). АВ1 (2—7 нг/г) встречался у шести видов, при этом наиболее часто уArctoparmelia centrifuga (в 42% проб). Для Т-2, ОА и ЭА показатели встречаемости и варьирования по накоплению лишь немного превышали найденные для АВ1, но у отдельных видов Parme-liaceae эти микотоксины обнаруживали достаточно часто. Так, Т-2 у A. centrifuga присутствовал в 74% образцов, ОА у H. physodes и Pseudevernia fur-furacea — в 89 и 93% соответственно, а ЭА у P. fur-furacea — в 71% случаев (табл. 2).
Остальные 10 микотоксинов могли быть определены, начиная с 20—100 нг/г. Среди них во всех видах были выявлены МФК, АОЛ, ЭМО. Однако встречаемость 75—100% везде сохраняли только АОЛ и ЭМО, а для МФК этот показатель был ниже у обоих видов рода Peltigera и в Xanthoriaparie-tina (табл. 3). Как оказалось, наибольшая интенсивность накопления АОЛ свойственна Umbilicada hyperborea (в среднем 2330 нг/г), МФК — H.physodes (1040 нг/г) и N. arcticum (1770 нг/г), ЭМО — A. centrifuga (18 300 нг/г), P. furfuracea
Таблица 2. Частота встречаемости (%) и содержание микотоксинов (минимальное—среднее—максимальное, нг/г) в лишайниках семейства РагтеИасеае
Микотоксин Alectoria sarmentosa (п = 26) Arctoparmelia centrifuga (п= 19) Bryoria capillaris (n = 20) Cetraria islándico (n = 95) Flavocetraria nivalis (n = 52) Evernia prunastri (n = 53) Hypogymnia physodes (n = 112)
ABj 8 3 42 2-4-6 — — — — —
Т-2 — 74 5-7-10 — 1 10 2 2 49 2-5-10 7 8-10-12
ЭА 8 3 37 4-4-5 10 3 13 2-5-10 — 24 4-12-30 9 10-22-60
СТЕ 100 15-80-140 100 15-100-370 100 8-30-100 90 7-70-610 100 16-155-160 100 20-95-260 100 10-100-1500
ОА 4 8 10 12 — — — 45 8-18-30 89 8-11-24
РоА — — — — — — 10 10-26-40
МФК 100 320-800-1680 100 310-770-1400 100 200-510-1300 87 20-43-165 100 35-95-285 100 70-612-1550 100 40-1040-7900
ЦИТ 77 30-70-160 100 50-1900-4500 100 60-110-160 41 20-45-160 54 25-50-110 100 270-1160-6310 100 45-140-400
AOJI 92 20-740-6310 100 100-630-1500 100 20-85-300 98 26-245-1000 75 26-215-770 100 45-290-1330 100 100-520-3240
ЗЕН 92 40-60-110 100 110-150-230 — 3 22-24-28 17 20-34-56 87 20-44-85 93 40-180-6300
ДОН — 26 50-80-100 5 146 39 50-95-180 - 32 80-130-260 97 100-240-700
ЭМО 100 200-470-1000 100 1600-18300-44700 100 140-600-1350 99 56-750-3940 100 100-4610-27260 100 620-3440-11750 100 150-1470-10500
ФУМ 50 100-120-200 37 130-160-200 10 100 9 63-160-290 — — 95 80-300-1350
ДАС 96 160-260-510 100 240-330-650 10 145 23 100-155-310 67 100-160-315 70 100-210-380 100 210-480-1100
цпк 27 120-310-560 5 130 5 360 74 100-215-690 - 75 100-430-1950 99 190-910-4100
PR 46 130-220-400 58 130-240-340 20 100-170-390 5 100-155-190 — 38 120-230-480 97 130-380-1550
ы
U)
о
W ►и
g
Я О
я
и
я g
К
0J
и
и о н К Л
о и
и К о и о м К Л и о
£
'■Б
Со в
II
Л
¿г
3
о оо
оо
о оо
3
о
о
3 3
о о о т
сл
6460 200
800- о 0 6
чо 0 4
0
сл 0
0 4
8 0
2 ^ ^
0 0 0 0
3 0 4 1 0 0
1 1 8 1 1
1
6
6 8 6
8 1
2
о чо
£ § £ § ^ т т
т,
о
о о
I
чз II к
¡3
чо
3
о сл
о £
о о
о О о чо
о о 12
о
о
00 ^
о
2 2
о
2
о 00
о
2 2
о Ю оо т
о
о
о о <"Ч 21
о
о
3
2
о о
о 00
о сл сл
о чо
о о 12
о о
£ £ сл
о
2
00
о о
о
3
а
о
2
2
0 8 0 2 -540 0 2 530 0
4 3 сл 0 0 330- 8 06 0 0 0 8 3 сл 5 5
о 240- 0 4 05 0 5
сл
о о
2
о
3
о о 00
чо чо
500 0 0 4 0 0 4 240
0 31 4 6 250- 3 4 280- 21 0 сл
0 0 8 0 8 03
в
-У ^
а чо
йЗ I I
^ ¡е
о
3
0 0 0
0 0 0 0 5 0 5 00 4 0 8 0 0
8 1 2 1 1
0 0 0 0 4 5 0 2 - 0 0 0 0 0 04 0 0 0 0
2 1 сл 1 51 1 1 8 5 5
2 0- 0 0 03 0 5 сч
2 8 сл
о о чо
сл
о
чо
о
о о о ^о о ^о
о
3
о о сл
о о
2
о
2
о
о
3
^
о
о о чо г^
К О
О
2
о
о о
чо
о о
о
а
I I
а
о ^ к в -3 £
О
о чо
2
о
3
о
о
2
о о
о
о о 1 21
о
о
о
0 0
4 0 1
4 3
0 - 0 - - 0
0 0 8 5 8 0 0
1 5 4 5 1
1 - 1
- 0 -
0 3 0
6 6
0 0
сл 8
г^ 3
0 6 3 4 0 4
3 5
- 1
0 -
4 0
1 5
о о о
сл о
3
о о о
2
о о
2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.