ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 5, с. 562-567
ХИМИЯ
УДК 546.100.02.3:547.15/17
ВВЕДЕНИЕ ДЕЙТЕРИЯ И ТРИТИЯ В 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 С ПОМОЩЬЮ ИЗОТОПНОГО ОБМЕНА
© 2015 г. В. П. Шевченко, И. Ю. Нагаев, С. Г. Петунов, К. В. Шевченко, А. С. Радилов, академик РАН Н. Ф. Мясоедов
Поступило 08.04.2015 г.
При использовании металлов-катализаторов одной группы определяющим фактором, влияющим на содержание изотопа водорода в молекулах 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 и на выход этого пептида, становится природа неорганического носителя, на поверхность которого наносится вещество. Определено распределение метки в аминокислотных остатках 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2. Показано, что включение метки в основном происходит в His. Синтез в присутствии дейтерия или трития позволил получить меченые препараты, содержащие соответственно около 3 атомов дейтерия или 2.5 атома трития (в районе 70 Ки/ммоль) на молекулу пептида.
DOI: 10.7868/S0869565215290149
Пептид 5-охо-Рго-Шз-Рго-МН2 — один из представителей класса рилизинг-гормонов гипоталамуса [1—5]. Данный гормон является нейро-пептидом, т.е. он относится к нейрогормонам пептидной группы. Он принимает участие в нормализации некоторых психических функций организма человека. Установлено, что введение в организм экзогенного 5-охо-Рго-Н18-Рго-МН2 при депрессиях приводит к антидепрессивному эффекту. Основная биохимическая функция данного гормона заключается в усилении синтеза пролактина. Этот пептид синтезируется и в мозге, поэтому может оказывать влияние и на его деятельность. Действие 5-охо-рго-н18-рго-мн2 на центральную нервную систему может проявляться в определенных поведенческих реакциях.
Целью настоящей работы был синтез меченого аналога 5-охо-Рго-Н18-Рго-МН2 с молярной радиоактивностью не ниже 50 Ки/ммоль. Такой меченый препарат необходим для проведения фар-макокинетических исследований. Также большое внимание было уделено процессу распределения метки между аминокислотами в этом пептиде, так как для проведения фармакокинетических исследований необходимо знать, сколько метки содержится в образующихся метаболитах.
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва, E-mail: nagaev@img.ras.ru
Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека, Капитолово Ленинградской обл.
Рассматривая 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2
С
N
O
N
NH2
O
NH
O
как объект для введения метки, необходимо отметить, что исходя из современных представлений, метка при изотопном обмене будет включаться преимущественно в имидазольное кольцо [6—8], т.е. в остаток гистидина.
Реакцию изотопного обмена проводили нагреванием механической смеси катализатора (5% КИ/А1203 или 5% Рё/А1203) с окисью алюминия, предварительно пропитанной раствором 5-охо-Рго-Н15-Рго-МН2 и затем лиофилизированной. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили на колонке Кгоша8И 100С18, ("Б^ша-АЫйеЬ", США), 8 х 150 мм, 7 мкм, система: элюент А — вода с 0.1%-й гептафтормасляной кислотой, элюент Б — метанол, линейный градиент Б — от 0 до 50% за 30 мин, скорость потока 2 мл/мин. Масс-спек-трометрические данные получали на приборе
Таблица 1. Зависимость выхода 5-охо-Рго-Н18-Рго-КН2 и содержания в нем дейтерия от температуры и природы инициатора спилловера водорода (5% Я^/А1203 и 5% Рё/А1203, время реакции 5 мин)
Т, °C 5% Rh/Al2O3 Выход, % 5% Pd/Al2O3 Выход, %
160 1.06* 76 1.08 82
180 1.94 65 230 70
200 2.54 62 2.71 62
220 3.26 43 3.49 43
240 3.85 22 3.74 22
260 4.10 12 4.09 13
* Среднее количество атомов дейтерия в молекулах 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2.
LCQ Advantage MAX ("Thermo Fisher Scientific", США) с ионизацией электрораспылением и прямым вводом раствора образца с концентрацией 10 мкг/мл в 0.1%-й уксусной кислоте.
На первой стадии работы определяли, насколько влияет природа металла-катализатора на эффективность изотопного обмена между 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 и дейтерием (табл. 1).
Как видно из приведенных данных, при работе с веществами, которые представляют собой меха-
ническую смесь носителя, пропитанного веществом, и катализатора различия выходов и среднего количества атомов дейтерия в молекулах 5-охо-Рго-Ы8-Рго-МН2 незначительны. Последнее может указывать на то, что главным фактором при возникновении кластеров с разным содержанием сольватированных катионов изотопов водорода и электронов [9, 10], по-видимому, является природа носителя, а не металла-инициатора активированных частиц водорода. Таким образом,
0.45 0.40
а°.35
(D
S 0.30 о
0 0.25 н
1 0.20
§ 0.15
3
4 0.10 0.05
0
0.25
(а)
CÖ
Л
(D О
с о н о
со К
ÖÜ §
Д
0.20
0.15
0.10
0.05
4
(в)
0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
0.25
4
(г)
2 3 4 5 Число атомов дейтерия
2 3 4 5 6 7 Число атомов дейтерия
Рис. 1. Образование изотопомеров при введении дейтерия (время реакции 5 мин) в 5-охо-Рго-Н1$-Рго-КН2 при 160°С (а, б), при 260°С (в, г) в присутствии 5% ЯИ/А1203 (а, в) и 5% Рё/Д1203 (б, г).
0
564 ШЕВЧЕНКО и др.
Таблица 2. Зависимость распределения дейтерия во фрагментах 5-охо-Рго-Н18-Рго-МН2 при изотопном обмене от температуры (время реакции 5 мин)
Т, °C 5% Rh/Al2O3 5% Pd/Al2O3
5-oxo-Pro His Pro-NH2 Соотношение 5-oxo-Pro His Pro-NH2 Соотношение
160 0.16 0.75 0.15 1.07 : 5.00 1 0.14 0.82 0.12 1.17 : 6.83 1
180 0.26 1.43 0.25 1.04 : 5.72 1 0.29 1.74 0.27 1.07 : 6.44 1
200 0.43 1.74 0.37 1.16 : 4.70 1 0.44 1.90 0.37 1.19 : 5.14 1
220 0.56 2.26 0.44 1.27 : 5.14 1 0.59 2.41 0.49 1.20 : 4.92 1
240 0.68 2.60 0.57 1.19 : 4.56 1 0.59 2.60 0.55 1.07 : 4.72 1
260 0.70 2.73 0.67 1.04 : 4.08 1 0.69 2.77 0.63 1.10 : 4.40 1
Таблица 3. Зависимость выхода 5-охо-Рго-Н18-Рго-МН2 и содержания в нем и в его фрагментах дейтерия от времени проведения реакции (5% КЬ/Л1203)
Т, °C Время, Содержание дейтерия Выход, % Соотношение дейтерия в аминокислотах
мин 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 5-oxo-Pro His Pro-NH2
180 5 1.94 0.26 1.43 0.25 65 1.04 : 5.72 1
10 2.22 0.31 1.64 0.27 58 1.15 : 6.07 1
200 5 2.54 0.43 1.74 0.37 62 1.16 : 4.70 1
10 3.13 0.50 2.18 0.45 52 1.11 : 4.84 1
15 3.36 0.54 2.34 0.48 48 1.12 : 4.88 1
20 3.44 0.54 2.40 0.50 46 1.08 : 4.80 1
30 3.84 0.66 2.58 0.60 38 1.10 : 4.3 : 1
установлен интересный факт, что если используются металлы-катализаторы одной группы, в данном случае платиновой, то определяющим фактором, влияющим на эффективность изотопного обмена, становится природа неорганического носителя, на поверхность которого наносится вещество.
На то же указывают и соотношения изотопо-меров, которые образуются в присутствии 5% ЯИ/Л1203 или 5% Рё/Л1203 (рис. 1).
Как видно из рисунка, при 160 и при 260°С как на ЯИ, так и на Рё форма распределения изотопоме-ров практически совпадает, т.е. изотопный обмен на образовавшихся кластерах идентичен. Так как пептид наносили на Л1203, а потом одну порцию смешивали с одним катализатором, а другую — с другим катализатором, то разница выхода и содержания дейтерия в веществе могла определяться только разной эффективностью взаимодействия с носителем активированных частиц водорода, генерируемых 5% ЯИ/Л1203 или 5% Рё/Л1203. Из чего следует, что эффективность изотопного обмена, главным образом, определяется образованием на поверхности носителя градиента кластеров с разной степенью насыщения сольвати-рованными катионами дейтерия, от характери-
стик которых и зависит вероятность включения метки в вещество.
Изменение содержания дейтерия в 5-oxo-Pro, His и Pro-NH2 в зависимости от температуры приведено в табл. 2.
Из приведенных данных следует, что включение метки в основном происходит в His, при этом с ростом температуры вклад гистидина в суммарное количество метки в пептиде несколько падает. Можно отметить, что хотя включение метки в 5-oxo-Pro и в Pro-NH2 примерно одинаково, в первый фрагмент метки включается больше, несмотря на то, что в его молекуле на два водорода меньше.
Если принять за 100% содержание дейтерия в 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2, то отношения содержания дейтерия в каждой из аминокислот при изменении температуры от 160 до 260°C в присутствии 5% Rh/Al2O3 будут следующие: при 160°C в 5-oxo-Pro содержится 15% дейтерия, в His — 71%, в Pro-NH2 - 14%; при 180°C - 13 : 74 : 13; при 200°C -
17 : 68 : 15; при 220°C - 17 : 69 : 14; при 240°C -
18 : 68 : 14; при 260°C - 17 : 67 : 16 соответственно. В присутствии 5% Pd/Al2O3 в том же интервале температур отношение содержания дейтерия в каждой из аминокислот в процентах выражалось
Доля изотопомера 0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0 1 2 3 4 5 6
Число атомов дейтерия
Рис. 2. Изменение содержания изотопомеров 5-охо-Рго-Ш8-Рго-МН2 в зависимости от времени проведения реакции.
как 13 : 76 : 11, 13 : 76 : 11, 16 : 70 : 14, 17 : 69 : 14, 16 : 70 : 14 и 17 : 68 : 15 соответственно.
Из полученных данных можно заключить, что уже при температурах выше 180—200°C отношение содержания метки в аминокислотных остатках 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 остается практически постоянным.
При исследовании зависимости выхода 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 и содержания в нем и в его фрагментах дейтерия от времени проведения реакции оказалось, что со временем включение метки растет, а ее распределение между аминокислотами не изменяется. Так, при проведении реакции при 180°C в течение 5—30 мин в His включалось 74% метки, а при проведении реакции при 200°C в течение 5—30 мин 69% метки (табл. 3).
Большее включение дейтерия со временем проведения реакции связано с изменением соотношения изотопомеров в 5-oxo-Pro-His-Pro-NH2 (рис. 2).
Как видно из приведенных данных, изотопо-мер, содержащий четыре атома дейтерия, постепенно становится преобладающим, а содержание изотопомера с двумя атомами дейтерия, максимальное при пятиминутном нагревании, умень-
шается и становится даже меньше, чем изотопомера с шестью атомами дейтерия.
При исследовании зависимости эффективности изотопного обмена от соотношения катализатор—носитель в механической смеси катализатора и А1203, пропитанной веществом, оказалось, что разбавление этой смеси равным количеством чистой А1203 мало влияет на молярную радиоактивность пептида, а ее диспергирован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.