ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 2, с. 222-228
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 581.1
ВВЕДЕНИЕ ГЕНА PHYB АРАБИДОПСИСА ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ Solanum tuberosum К УФ-B ОБЛУЧЕНИЮ
© 2015 г. В. Д. Креславский*,**, А. А. Кособрюхов*, А. Н. Шмарев*, Н. П. Аксенова**, Т. Н. Константинова**, С. А. Голяновская**, Г. А. Романов**
* Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН,
Пущино, Московская обл.
**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева
РАН, Москва Поступила в редакцию 15.07.2014 г.
Изучено влияние суперпродукции фитохрома В на устойчивость фотосинтетического аппарата 5060-дневных трансгенных растений картофеля (Solanum tuberosum L.) Дара-5 (с умеренной экспрессией PHYB) и Дара-12 (с активной экспрессией PHYB) к облучению УФ-B. У необлученных растений не найдено существенных различий между нетрансформированным контролем (НТ) и вариантами Дара-5 и Дара-12 по скорости фотосинтеза (Pn) и флуоресцентным параметрам (Fv/Fm, qN, qP), тогда как содержание фотосинтетических пигментов на 1 см2 площади листа было выше у трансгенных растений. Облучение УФ-B приводило к снижению скорости фотосинтеза у НТ растений в среднем на 35-45%, тогда как у Дара-12 — только на 20-25%. Воздействие УФ-B снижало величины амплитуд как быстрой, так и медленной компоненты замедленной флуоресценции (ЗФл), что является показателем снижения эффективности функционирования фотосистемы II (ФС II). Снижение максимальной амплитуды медленной компоненты ЗФл было заметно меньше у Дара-12 (19%), чем у НТ (33%). Максимальный фотохимический квантовый выход ФС II, характеризуемый величиной Fv/Fm, также снижался более значительно у НТ по сравнению с Дара-12. Линия Дара-5 по устойчивости фотосинтеза и ФС II к УФ-B была промежуточной, но ближе к НТ, чем к Дара-12. Полученные результаты показывают, что у растений картофеля, активно экспрессирующих ген апо-белка фитохрома В (PHYB) из арабидопсиса, наблюдается повышенная устойчивость фотосинтетического аппарата к облучению УФ-B по сравнению с растениями НТ, что скорее всего, связано с более высоким содержанием в листьях хлорофилла, каротиноидов и флавоноидов.
Ключевые слова: Solanum tuberosum - трансгенные растения - ген PHYB - скорость фотосинтеза -фотосистема II - стресс-устойчивость - УФ-B
DOI: 10.7868/S0015330315020116
ВВЕДЕНИЕ
Система растительных фоторецепторов, в число которых входят фитохромы, регулирует процессы роста и фотоморфогенеза, и их роль в этих процессах во многом изучена [1-4]. Значительно в меньшей степени известно о взаимосвязи активности фотосинтетического аппарата (ФА) и его стресс-устойчивости с состоянием этих фоторецепторов и их содержанием.
Сокращения: ДКС — дальний красный свет; КС — красный свет; ЗФл - замедленная флуоресценция; НТ - нетрансфор-мированный контроль; ФА - фотосинтетический аппарат; ФхВ - фитохром В; Хл - хлорофилл.
Адрес для корреспонденции: Креславский Владимир Данилович. 142290 Пущино, Институтская ул., 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: vkreslav@rambler.ru
Для исследований такого рода используют растения с недостатком или с избытком фитохрома какого-нибудь типа, в частности трансгенные растения картофеля Дара-12 (Д-12) и Дара-5 (Д-5), суперпродуценты фитохрома В (ФхВ) - ключевого фитохрома зеленых растений, которые сравнивают с диким нетрансформированным типом [5, 6]. Этот тип фитохрома преобладает в зеленых растениях, активируется красным светом (КС) с максимумом 660 нм и отличается от других типов фи-тохрома обратимостью эффектов КС при последующем облучении растений дальним красным светом (ДКС) с максимумом 730 нм [2, 3]. Согласно имеющимся данным, ФхВ контролирует синтез фотосинтетических пигментов, образование
хлоропластов [7], а также синтез некоторых фотосинтетических белков и активность устьиц [8].
Показано также, что в трансгенном растении картофеля — суперпродуценте ФхВ, экспрессиру-ющем трансген PHYB (Д-5 и Д-12), повышена скорость фотосинтеза в расчете на единицу площади листа, а также устойчивость ФА к видимому свету высокой интенсивности [6]. Авторы предположили, что повышенная устойчивость может быть следствием увеличения содержания хлоро-филлов (Хл (а + b)) или проводимости устьиц. В работе [9] обнаружена повышенная устойчивость растений Д-12 и Д-5 к действию УФ-В-ради-ации. Однако влияние трансформации на устойчивость ФА и его компонентов (ФС II) к УФ-ради-ации не было изучено, и оставалось неясным, чем обусловлено повышение устойчивости ФА: изменениями ли на уровне самого ФА или вызванными экспрессией PHYB морфологическими/биохимическими изменениями листовой пластинки.
В задачу настоящей работы входило исследование влияния суперпродукции ФхВ в листьях растений картофеля на активность фотосинтетического аппарата, содержание фотосинтетических и УФ-поглощающих (флавоноиды) пигментов в условиях физиологической нормы и при УФ-В-индуцированном стрессе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили две линии картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Дезире и полученные на их основе трансгенные линии с введенным геном PHYB из Arabidopsis thaliana (ген AtPHYB), кодирующим синтез апобелка ФхВ: линия Дара-5 (вариант Д-5) и линия Дара-12 (вариант Д-12). Ген AtPHYB находился под контролем промотора 35S CaMV. Это обеспечивало экспрессию трансгена во всех органах трансформированных растений, включая листья. В качестве контроля использовали нетрансформированный картофель сорта Дезире (вариант НТ). Ранее посредством иммуноблоттинга с использованием белковых экстрактов из листьев картофеля дикого типа и трансформантов было обнаружено, что уровень экспрессии гена AtPHYB у трансгенных растений Д-5 и Д-12 выше по сравнению с НТ в 4 и 20 раз соответственно [6]. Таким образом, линия Д-12 имеет более высокий уровень экспрессии трансгена, чем линия Д-5.
Первоначально растения культивировали in vitro на агаризованной среде Мурасиге-Скуга в течение 30 дней при интенсивности света 100 мкЕ/(м2 с), после чего перемещали в теплицу и выращивали в 5-литровых сосудах с почвой в период с июня по август при естественной интенсивности света 1100 ± 200 мкЕ/(м2 с), дневной
температуре 28-30°С и ночной — 20-22°С. Исследования проводили в утренние часы с 10:00 до 12:00; возраст растений — 50-60 дней. Для определения скорости фотосинтеза, активности ФС II, а также содержания пигментов использовали по 5-7 верхних, полностью развитых листьев 3- и 4-го яруса каждого варианта. Скорость фотосинтеза определяли с помощью инфракрасного газового анализатора LCPro+ фирмы "ADC Bio-Scientific Ltd.", соединенного с листовой камерой площадью 6.25 см2, при насыщающей интенсивности света.
Активность ФС II оценивали с помощью переменной и замедленной флуоресценции хлорофилла (Хл) а. Индукционные кривые записывали с помощью ПАМ-флуориметра (Junior-PAM, "Heinz Walz", Германия), рассчитывая соответствующие флуоресцентные параметры Fv/Fm, qP, qN и NPQ. Миллисекундную замедленную флуоресценцию (ЗФл) хлорофилла клеток регистрировали с помощью сконструированного нами фосфороскопа [10]. Время возбуждения и регистрации флуоресценции — 1.3 мс. Промежуток между возбуждением и регистрацией был равен 3.5 мс. В качестве источника действующего света использовали лампу КГМ 150 Вт. Интенсивность на уровне объекта составляла величину 2000 мкЕ/(м2 с). Для регистрации использовали фотоумножитель (ФЭУ-119) и персональный компьютер с аналого-цифровым преобразователем L-783 (L-Card). Индукционные кривые ЗФл регистрировали в цифровом виде, используя разработанную нами компьютерную программу. В качестве параметра, коррелирующего с уровнем светоиндуцируемого на тилакоидных мембранах протонного градиента, использовали отношение (/max2 - D)/D, где Imax2 — максимум медленной компоненты кривой, а D — минимум на индукционной кривой (рис. 1). Оценивали также отношение (Imax1 - D)/D, где Imax1 - максимум быстрой компоненты ЗФл. Для флуоресцентных измерений из верхней трети листьев слева и справа от основной жилки вырезали по два диска диаметром 1 см. Для сравнения с НТ использовали высечки из листьев Д-12, которые были больше по весу, чем НТ на 30 ± 10%.
Препараты тилакоидных мембран выделяли методом Berthold с соавт. [11]. Концентрация Хл в использованных препаратах составляла 30 мкг/мл. Содержание Хл a и b, а также каротиноидов измеряли в этанольных экстрактах, используя известные коэффициенты поглощения [12]. УФ-погло-щающие метанол-экстрагируемые соединения (преимущественно флавоноиды) выделяли из высечек свежих листьев методом Mirecki с соавт. [13]. Использовали по 15—25 дисков, вырезая по 5 дисков диаметром 1 см из каждого листа. Высечки из листьев выдерживали 24 ч в кислом ме-
250
200
150
(а)
В £
о «
и
Я
я
(U
Я
о о
р
о ^
ч «
а
я я
(U
ч д
(U
а
00
100 -
50 -
0
250 200 150 100 50
д.1200
о
Н 1000
£ о о я <ч
и
о Я о н я
И
800 600 400 200 0
313 нм
365 нм
300 400 500 600 700 Длина волны, нм
800
6 8 10 12 14 Время, с
Рис. 1. Влияние УФ-В облучения (45 мин) на индукционные кривые ЗФл 60-дневных растений картофеля. а — нетрансформированный контроль (НТ), б — трансгенные растения Дара-12 (Д-12). 1 — без облучения, 2 — после УФ-В облучения. Показаны типичные кривые.
таноле (метанол : вода : HCl, 78 : 20 : 2) при 4°С. Затем на спектрофотометре М-40 ("Karl Zeiss", Германия) определяли оптическую плотность при 327 нм и пересчитывали на количество флавоно-идов (ед. опт. плотности в расчете на сухой вес листа или на 1 см2 площади его поверхности).
После определения фотосинтетических показателей у растений их облучали УФ-B с помощью лампы ЛЭ-30-1 в диапазоне длин волн 280-380 нм (максимум 313 нм, рис. 2). Интенсивность УФ-об-лучения на уровне листьев составляла величину 12 Вт/м2, время облучения 15 или 45 мин. Сразу после этого проводили определение скорости фотосинтеза, параметров флуоресценции и содержания пигментов в листьях. Скорость фотосинтеза определяли также у растений, выраще
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.