МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 169-175
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.253+579.812.11
ВЫДЕЛЕНИЕ ДИССОЦИАНТОВ ПУРПУРНОЙ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ ЯИОВОБЛСТЕЯ ЗРИЛЕЯОЮЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ, ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ
И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ © 2013 г. Р. Н. Ивановский, Е. С. Милько, Д. М. Милько
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии
Поступила в редакцию 22.11.2012 г.
Впервые установлена способность пурпурных фотосинтезирующих бактерий расщепляться на варианты (диссоцианты). Из популяции Rhodobacter sphaeroides выделены Я- и М-диссоцианты. Методом ПЦР фрагментов генов 168 рРНК установлена их принадлежность к исходному штамму. Я- и М-диссоцианты различаются морфологией колоний и устойчивостью к действию ряда физических и химических факторов. Я-диссоциант Rhb. sphaeroides имеет селективные преимущества при росте на свету, при аэрации, повышении температуры культивирования и УФ-облучении. М-диссоциант имеет селективные преимущества при росте в аэробных условиях в темноте и при увеличении концентрации №С1.
Ключевые слова: фотосинтезирующие бактерии, Rhodobacter sphaeroides, адаптационная изменчивость, R- и M-диссоцианты.
DOI: 10.7868/S0026365613020067
Диссоциация — это расщепление однородной популяции бактерий на варианты (R-, S- и M-дис-социанты), различающиеся генетическими, фи-зиолого-биохимическими и морфологическими свойствами. Возникновение диссоциантов в популяции определяется, в основном, генетическими перестройками внутри клетки, которые происходят с частотой 10-2—10-4 на клеточное деление. Одними из первичных фенотипических изменений являются изменения в клеточной оболочке: капсуле, клеточной стенке и цитоплазматической мембране. Эти особенности клеток обусловливают постоянные и обратимые изменения многих физио-лого-биохимических и морфологических свойств диссоциантов: потребности в питательных веществах и скорость роста, устойчивость к действию внешних факторов, способность к синтезу практически ценных веществ и др. [1, 2].
Из трех диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus наибольшим размером капсулы обладают М-клет-ки, наименьшим — R-клетки; максимальная толщина клеточной стенки у R-диссоцианта (40 нм), наименьшая — у М-диссоцианта (20 нм). Наибольшее количество ненасыщенных жирных кислот в липидах содержат М-клетки [1]. У диссоциантов Pseudomonas aeruginosa различаются пути использо-
Автор для корреспонденции (e-mail: mguru@mail.ru).
вания глюкозы: у R-диссоцианта преобладает окисление ее до СО2 и воды; у М-клеток — брожение с образованием муравьиной кислоты, причем активность дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата на два порядка ниже, чем у двух других диссоциан-тов [3], у S-диссоцианта возможно переключение с одного пути использования глюкозы на другой. Поэтому при росте R-клетки P. aeruginosa потребляют наименьшее количество основных биогенных субстратов, а М-диссоциант — наибольшее, особенно глюкозы [4]. Соответственно, максимальной скоростью роста обладает R-диссоциант, и в стационарной фазе роста он доминирует при достаточном содержании биогенных элементов в среде [5].
В доступной для нас литературе не найдено сведений о диссоциации у фотосинтезирующих бактерий. Целью настоящей работы является выделение колониально-морфологических дис-социантов из популяции пурпурных несерных бактерий и изучение их некоторых молекулярных, физиолого-биохимических и морфологических свойств.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследований была бактерия Rhodobacter sphaeroides 2R из коллекции культур кафед-
ры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова, которая является одним из классических объектов изучения физиологии, метаболизма, фотосинтеза и генетики пурпурных бактерий. Это аноксигенная фототрофная бактерия с очень пластичным метаболизмом, способная расти как анаэробно на свету, так и в аэробных условиях на свету и в темноте. Она способна к автотрофному росту, используя в качестве донора электронов молекулярный водород, а также к гетеротрофному росту за счет использования широкого спектра органических соединений [6].
Бактерии выращивали в люминостате при 30°С на среде Ормерода в присутствии 0.2% ма-лата [6] во флаконах, доверху заполненных средой для создания анаэробных условий. Для создания аэробных условий бактерии выращивали в колбах на 250 мл с 50 мл среды на качалке при 250 об./мин. Суточную культуру использовали как посевной материал, который вносили в количестве 5%.
Число жизнеспособных клеток и соотношение диссоциантов в популяции определяли подсчетом колоний (КОЕ) на агаризованной среде (МПБ + сусло, 1 : 1). Для каждого варианта опыта использовали по 10—12 чашек Петри, на каждую из которых наносили по 0.1 мл суспензии соответствующего диссоцианта, разведенной в физиологическом растворе в 101—107 раз. Чашки выдерживали в люминостате в течение 2—3 сут.
Для выяснения влияния УФ-облучения на рост диссоциантов использовали агаризованную среду МПБ + сусло. Источником УФ-облучения являлась установка с двумя лампами БУФ-15, смонтированными параллельно. Использовали следующие дозы облучения: 0.4; 0.75; 1.5; 3.75; 7.5 тыс. эрг/мм2 , что соответствует экспозиции в течение 3, 6, 12, 30 и 60 с при расстоянии 5 см от ламп. Число выживших клеток подсчитывали после их подращивания на чашках Петри в течение 2—3 сут в люминостате.
Для выявления влияния температуры и повышенных концентраций №С1 на рост диссоци-антов их выращивали на свету в анаэробных условиях в течение двух или трех суток для Я- или М-диссоциантов соответственно. №С1 добавляли в концентрации от 1 до 8%. Использовали температуру культивирования 20, 30 и 35°С. Количество клеток и состав популяции определяли рассевом аликвот культур на плотную среду.
При проведении полимеразной цепной реакции гена 168 рРНК диссоциантов ЯНЬ. 8ркавго1-des была использована система универсальных праймеров [7]. Для амплификации практически полноразмерного фрагмента гена 168 рРНК (1425 н) использовали пару праймеров 8-27Г AGAGTTTGATCMTGGCTCAG, 1492г TACG-GYTACCTTGTTACGACTT. Для выделения ДНК
применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли [8]. Сравнительный анализ полученых de novo последовательностей 16S рРНК с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast). Редактирование и сравнение последовательностей проводили с помощью набора методов, реализованных в программном продукте BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html).
Во всех опытах за контроль принимали рост диссоциантов бактерий на свету в анаэробных условиях при 30°С. В таблицах и рисунках представлены средние данные из трех опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение диссоциантов. Диссоцианты легче выделяются из популяции более старых культур бактерий, выросших в жидкой среде [1]. Rhb. sphaeroides культивировали в среде Ормерода на свету в анаэробных условиях в течение 7 сут. При последующем рассеве на плотной среде вырастали колонии двух типов. В большинстве это были колонии темно-красного цвета, выпуклые, матовые, диаметром 2—2.5 мм (рис. 1а), при большем увеличении видна неровность поверхности и волнистый край колонии.
Кроме этого, обнаружены более мелкие колонии розового цвета гладкие, блестящие с ровным краем, диаметром 1 мм (рис. 1б), в проходящем свете вокруг них видна бесцветная каемка кап-сульного материала (рис. 1в). Единичные колонии обоих типов переносили в жидкую среду Ор-мерода, культивировали в течение 5 сут на свету в анаэробных условиях, затем делали рассев на плотную среду. Среди розовых колоний обнаружены единичные крупные темно-красные колонии, т.е. наблюдается реверсия к исходному мор-фотипу, что необходимо сопровождает обратимые диссоциативные переходы. Размер клеток обоих типов колоний мало отличим: это короткие палочки, одиночные или соединенные по две.
ПЦР генов 16S рРНК. Для подтверждения принадлежности выделенного диссоцианта к исходному штамму Rhb. sphaeroides 2R была проведена полимеразная цепная реакция фрагментов их генов 16S рРНК, а также типового штамма Rhb. sphaeroides X53853 (табл. 1). Показано, что последовательность генов 16S рРНК выделенного диссоцианта и исходного штамма идентичны (100% гомологии) между собой. С последовательностью типового штамма уровень сходства 99.9%.
На основании вышеприведенных морфологических и молекулярных исследований исходный штамм можно идентифицировать как R-диссо-
циант, а вновь выделенный — как М-диссоциант Rhb. sphaeroides.
Диссоциация складывается из двух процессов: возникновения диссоциантов в результате изменений в геноме клетки и селекции возникших вариантов под воздействием внешних условий [1]. Поэтому в дальнейшем сравнивали устойчивость диссоциантов к действию некоторых физических и химических факторов.
Освещенность и аэрация. Изучали влияние освещенности и аэрации на рост R- и М-диссоциантов Rhb. sphaeroides (рис. 2). R-диссоциант одинаково хорошо растет на свету как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Максимальное количество клеток достигается на вторые сутки роста.
На свету в анаэробных и аэробных условиях клетки М-диссоцианта, как правило, растут медленнее, чем R-диссоцианта. Максимальное число клеток достигается к третьим суткам культивирования. При этом рост клеток М-диссоцианта в анаэробных условиях на свету наблюдается только после односуточного лаг-периода. В аэробных условиях а свету рост М-диссоцианта начинается без заметного лаг-периода.
В аэробных условиях в темноте некоторое увеличение числа клеток R-диссоцианта наблюдается только в первые сутки культивирования. При этом скорость роста и урожай клеток М-диссоци-анта в темноте в аэробных условиях такой же, как и на свету в аэробных условиях. Таким образом, заметные селективные преимущества клетки М-диссоцианта по сравнению с R-диссоциантом приобретают только при росте в темноте в аэробных условиях.
В темноте в анаэробных условиях на среде с малатом рост обоих диссоциантов отсутствовал. Это указывает на то, что малат в темноте в а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.