ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 596-601
УДК 677.46
ВЫДЕЛЕНИЕ ГАЛАКТОМАННАНОВ СЕМЯН СОФОРЫ ЯПОНСКОЙ (Styphnolobium japonieum) И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СТРУКТУРЫ
© 2004 г. Н. И. Смирнова, Н. М. Местечкина, В. Д. Щербухин
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071; e-mail: vds@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 06.08.2003 г.
Из холодного и горячего водных экстрактов семян софоры японской (Styphnolobium japonicum (L.) Schott) изолированы фракции (1 и 2) галактоманнана с общим выходом 12.88%, которые отличались соотношением мономеров манноза (Ман) : галактоза (Гал) 4.8 : 1 и 5.3 : 1 и молекулярной массой 1190 и 1400 кДа. Их водные растворы были оптически активны: [a]D = +4.80° и [a]D = -3.36° и обладали высокой вязкостью [п] = 1028.8 и 1211.2 мл/г. 13С-ЯМР спектры обеих фракций были идентичны по числу и положению сигналов, что свидетельствует об их одинаковой первичной структуре. Химическими и спектральными методами установлено, что макромолекула галактоманнана имеет главную цепь, состоящую из 1,4^-Б-остатков маннопиранозы, часть которых (17% во фракции 1 и 16% во фракции 2) a-галактозилирована в положении С-6. Встречаемость разнозамещенных ман-нобиозных звеньев в цепи, рассчитанная по ЯМР-спектру фракции 1, составляет для двузамещенно-го звена Гал(Ман-Ман)Гал - 0.13, для суммы однозамещенных звеньев Гал(Ман-Ман) и (Ман-Ман)Гал - 0.37 и для незамещенного блока Ман-Ман - 0.50.
Водорастворимые галактоманнаны составляют большую группу полисахаридов растений. Среди изученных галактоманнанов большинство изолировано из семян растений семейства бобовых [1]. Галактоманнаны локализованы в клеточных стенках эндосперма семян, их относят к полифункциональным полисахаридам. Они являются углеводным резервом семян, кроме того, регулируют водный режим семени при прорастании, а в случае сильно развитого эндосперма выполняют механическую функцию защиты зародыша [1]. Галактоманнаны широко используются в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности, причем производство трех коммерческих препаратов достигает значительных объемов [1, 2].
В состав макромолекулы этих биополимеров входят два моносахарида D-манноза и D-галактоза в молярном соотношении от 1 : 1 до 5.3 : 1. Здесь же отметим, что соотношение мономеров является важнейшей характеристикой гетеропо-лисахаридов, во многом определяющим их физико-химические свойства.
Сведения о полисахариде из семян софоры Styphnolobium japonicum (L.) Schott (ранее Sophora japónica L.) очень скупы [3, 4]. Галактоманнан был получен спиртовым осаждением из водного экстракта. Выход после очистки составил 4.3%. Соотношение мономеров было определено как 5.26 : 1. Молекулярная масса, определенная по редуцирующей способности, оказалась 7000 Да. Химическими методами были установлены типы и конфигурации связи в по-
лимере [3]. В недавно опубликованной статье [4] обсуждалось распределение боковых галактозных остатков вдоль главной маннопиранозной цепи галактоманнана софоры по результатам трансмиссионной электронной микроскопии.
Среди бобовых умеренных широт доминирует одно из трех подсемейств бобовых, а именно подсемейство мотыльковых Faboidae, галактоманнаны большинства видов которого характеризуются низким и средним значениями Ман : Гал (1-2.5) [1]. В то же время софора, относящаяся к этому подсемейству, содержит галактоманнан, который по литературным данным [3] обладает самым высоким среди бобовых соотношением Ман : Гал (более 5).
Софора японская, интродуцированный и хорошо акклиматизировавшийся на юге России вид семейства бобовых, содержащий галактоманнан с рекордно низким количеством галактозы, представляет собой уникальный объект исследования.
Цель работы - выделение полисахарида холодной и горячей экстракцией из семян, собранных на Северном Кавказе; установление содержания галактоманнана в семенах, определение его моносахаридного состава, а также структуры методом 13С-ЯМР спектроскопии.
МЕТОДИКА
Материалом для исследования служили семена софоры японской (Styphnolobium japonicum (L.) Schott), любезно предоставленные А.Д. Михее-
вым, сбор которых был проведен на Северном Кавказе в октябре 2001 г.
Выделение галактоманнана проводили следующим образом. Для отделения эндосперма от остальных частей к 25 г целых семян приливали 100 мл кипящего 60%-ного этанола и помещали с обратным холодильником на кипящую водяную баню на 30 мин. Набухшие семена вручную разделяли на три части : семенную кожуру, зародышевую часть и эндосперм. Массовые доли частей семени определяли 3-кратно в пробах из 10 семян. Они составили для оболочек -26%, семядолей - 41% и эндосперма - 33%. В дальнейшей работе использовали эндосперм, который после замораживания в жидком азоте растирали в ступке и высушивали. Измельченную ткань фиксировали 100 мл кипящего 80%-ного этанола в течение 1 ч с обратным холодильником. Спиртовой экстракт декантировали, фиксированный материал высушивали на воздухе.
Водную экстракцию при комнатной температуре проводили следующим образом. К 7 г измельченного фиксированного эндосперма приливали 300 мл воды и помещали на магнитную мешалку на 9 ч. Экстракт отделяли центрифугированием (2500 30 мин) и добавляли 2 объема этилового спирта. Выпадал светлый осадок, его отделяли центрифугированием (2500 20 мин), промывали возрастающей концентрацией этанола (75-96%) и высушивали препарат водорастворимых полисахаридов (ВРПС-1) в эксикаторе (выход 9.4% от массы эндосперма).
Далее проводили экстракцию горячей водой. Для этого к оставшемуся после после извлечения ВРПС-1 растительному материалу приливали 300 мл горячей (70°С) воды и экстрагировали при этой температуре с постоянным перемешиванием 6.5 ч. По мере загустевания экстракта, прибавляли порциями горячую воду до конечного объема 850 мл. Вязкий экстракт декантировали, а к остатку приливали новую порцию горячей воды (250 мл) и продолжали экстракцию в тех же условиях еще 3 ч. Полученные экстракты объединяли и добавляли 2 объема 96%-ного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (2500 20 мин), а затем поступали так же, как и при предыдущей экстракции. Выход препарата (ВРПС-2) -33% от массы эндосперма.
Выделение галактоманнанов из обоих препаратов (ВРПС-1 и ВРПС-2) проводили по общепринятой методике реактивом Фелинга [5], который добавляли к их водным растворам. При этом галак-томаннаны, избирательно образуя комплексное соединение с ионами меди, выпадали в осадок. Их отделяли центрифугированием (2500 30 мин), а затем комплекс разлагали 5%-ным раствором соляной кислоты в спирте, регенерируя индивидуальные полисахариды. Выход из ВСРП-1 очищенного галактоманнана (фракция 1) составил
7.6% от массы эндосперма. Выход из ВРПС-2 очищенного галактоманнана (фракция 2) - 31%.
Полный кислотный гидролиз препаратов вели 2 н. H2SO4 4 ч на кипящей водяной бане.
Частичную деполимеризацию галактоманнанов проводили по методу Божика так, как описано в [6]. Время деполимеризации подбирали в отдельном эксперименте.
Газожидкостную хроматографию смесей углеводов проводили в виде ацетатов полиолов на приборе ЛХМ-80-3 (СССР), колонка 5% XE-60 на Хро-матоне N-AW (0.3 х 300 см) при температуре 220°C.
Относительную вязкость водных растворов полисахаридов измеряли в вискозиметре Оствальда (т0 = 110 сек). Характеристическую вязкость находили графической экстраполяцией концентрационной зависимости удельной вязкости к нулю. Найденную характеристическую вязкость использовали в формуле Дублие [7] для расчетов молекулярных масс галактоманнанов.
Оптическую активность растворов в воде измеряли на поляриметре DIP-360 "Tasco" (Япония) в 0.5 дм кювете.
ИК-спектры записывали на спектрофотометре UR-20 "C. Zeiss" (Германия), запрессовывая образцы в таблетки с KBr.
13С-ЯМР спектроскопию проводили на спектрометре AM 300 ("Bruker", Германия) в D2O (3%-ный раствор) при 55°C. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетон (31.45 м.д.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Хроматографическим анализом кислотного гидролизата целых семян был определен пул нейтральных моносахаридов. В гидролизате определено 6 моносахаридов, причем доминировали манноза и галактоза (в сумме 65%), тогда как на долю остальных сахаров (рамноза, арабиноза, ксилоза и глюкоза) приходилось 35%. Исходя из общепринятого положения о локализации галактоманнана исключительно в эндосперме, последний механически отделяли. Действительно, в гидролизате эндосперма манноза и галактоза в сумме составили 87.8% от всех сахаров. К тому же при использовании в дальнейшей работе эндосперма отпадала необходимость удаления липи-дов и белков, локализованных в зародыше. При фиксации эндоспермальной ткани кипящим 80%-ным раствором этанола одновременно удалялись низкомолекулярные соединения (моно- и олигосахариды, аминокислоты и др.).
Полученный спиртовым осаждением из холодного водного экстракта эндосперма препарат водорастворимых полисахаридов (ВРПС-1) содержал в своем гидролизате те же моносахариды, что и целые семена и эндосперм, однако доля основных компонентов - маннозы и галактозы повысилась до
2М
_i_i_i_i_i_i_i_i_
100 95 90 85 80 75 70 65 м.д.
13
С-ЯМР-спектр галактоманнана семян софоры японской (фракция 1). М - монозамещенный остаток D-маннопира-нозы; М+ - дизамещенный остаток D-маннопиранозы; Г - остаток D-галактопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.
94.4% (в сумме). Соотношение Ман : Гал составило 4.75. Изолирование галактоманнана из водного раствора ВРПС-1 проводили селективным осаждением через медный комплекс [5].
Препарат фракции 1 представлял собой белый порошок, растворяющийся в воде после набухания. По результатам анализа в гидролизате были идентифицированы только манноза и галактоза в соотношении 4.80 : 1, другие сахара были в следовых количествах. Практически неизменившееся соотношение компонентов служило критерием гомогенности гетерополисахарида.
Растительный материал подвергали дальнейшей экстракции при 70°С. Спиртовым осаждением было получено значительно большее количество осадка (ВРПС-2, выход 33%), дающего при гидролизе тот же набор моноса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.