МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 4, с. 560-566
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.864+579.8(265.72)
ВЫДЕЛЕНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ БАКТЕРИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРЕМЯ ГУБКАМИ
ИЗ ЮЖНО-КИТАЙСКОГО МОРЯ
© 2007 г. Чж. Ли1, Е. Ху, Я. Хуанг, И. Хуанг
Лаборатория морской биотехнологии, Колледж биологических наук и биотехнологии,
Университет Цзяо Тонг, Шанхай, КНР
Поступила в редакцию 08.06.2006 г.
Губки являются общепризнанным источником новых противовирусных, противоопухолевых и ци-тотоксических препаратов, представляющих интерес для фармакологии и медицины [1]. Губки - сидячие организмы, отфильтровывающие пищевые частицы из воды. Накапливающиеся в результате внутри тела губок микроорганизмы (гетеротрофные бактерии, археи, цианобактерии и одноклеточные водоросли) составляют 40-60% и более от их биомассы [2]. Получены свидетельства участия микроорганизмов в процессах вторичного метаболизма, которые ранее считались присущими собственно губкам [3]. Выделение микроорганизмов, способных к синтезу биологически активных веществ, позволит поставить производство лекарств морского происхождения на промышленную основу.
Из губок был выделен ряд бактерий, обладающих антимикробной активностью [4]; были идентифицированы некоторые метаболиты ассоциированных с губками бактерий [5]. Данные о метаболитах губок рода Stelletta немногочисленны [6]. Авторам удалось найти лишь одну публикацию о метаболитах губки Stelletta tenui [7]. Большую ценность представляют губки рода Halichondria; так, из H. melanodocia была выделена окадаевая кислота [8]. Из губки Dysidea avara был выделен аварол, обладающий активностью против ВИЧ [9]. Хотя существует ряд публикаций, посвященных метаболитам [10], культуре клеток [11] и выращиванию [12] губки Dysidea avara, информация об ассоциированных с ней бактериях весьма скудна. Нам не известны работы, посвященные бактериям, ассоциированным с губками Stelletta tenui (Lindgren), Halichondria rugosa и Dysidea avara; наша публикация по применению метода DGGE для исследования основных компонентов бактери-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: zyli@sjtu.edu.cn).
ального сообщества является единственным исключением [13].
В данной работе были исследованы бактерии, выделенные из губок S. tenui, H. rugosa и D. avara и потенциально обладающие антибактериальной, антигрибковой или энзиматической активностью. Среда, использованная для выделения бактерий, содержала 10 г/л пептона, 5 г/л мясного экстракта и искусственную морскую воду (г/л дистиллированной воды): NaCl, 26.518; MgCl2, 2.447; MgSO4, 3.305; CaCl2, 1.141; KCl, 0.725; NaHCO3, 0.202; NaBr, 0.083. pH доводили до 7.2-7.4. Для получения плотных сред добавляли 1.5% агара. Для подавления роста грибов вносили 40 мкг/мл нистатина. Чашки инкубировали при 28°C в течение двух-трех суток. Выделенные штаммы обозначали буквами A, B, C в зависимости от источника (S. tenui, H. rugosa и D. avara соответственно) в сочетании с порядковыми номерами. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агаре с использованием следующих штаммов грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, полученных из Китайского информационного центра по биоразнообразию, Институт микробиологии АН КНР: Escherichia coli AS 1.3373, Staphylococcus aureus AS 1.2465, Pseudomonas fluorescens AS 1.55, Bacillus subtilis AS 1.3343, Candida albicans AS 2.2086, Pacecilomyces variotti AS 3.776, Aspergillus niger AS 3.5487. Протеазную, липазную, агаразную и хитиназную активности определяли методами, описанными Рондон и со-авт. [14]. Для выделения ДНК использовали модифицированный метод экстракции смесью фенол-хлороформ [13]. ПЦР проводили с использованием Master Cycler Gradient (HYBAID, Великобритания) с праймерами 27f (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') и 1492r (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Состав смеси для ПЦР: праймер 27f - 0.5 мкл; праймер 1492r -0.5 мкл; 10х раствор для ПЦР (50 мМ mpuc-HCl,
76
36
37
92-A45 (DQ274116)
85jlA64 (DQ274117)
57
16
19
89
79
4 4 13
1 Bacillus sporothermodurans (U49080) A09 (DQ274112) Bacillus firmus (X60616) 87iA32 (DQ274115)
_'Staphylococcus epidermis изолят CV64 (AJ717377)
98_|A75 (DQ091004)
88Staphylococcus lentus штамм: SSH39 (AB219154) Bacillus cereus штамм J-1 (AY305275) A71 (DQ274118) 3LA77 (DQ274119) ,A08 (DQ091003) 89~lBacillus sp. штамм: SSA3 (AB017587)
-Clostridium josui (AB011057) —
-Roseobacter sp. GAI-109 (AF098494) -
_99iA06 (DQ274111)
'Acinetobacter johnsonii штамм: S35 (AB099655) Alcaligenes sp. IS-17 (AY346138) A72 (DQ180141) Alcaligenes faecalis (AB091759) A18 (DQ274114) Alcaligenes sp. L981 (AY371437) A05 (DQ091002)
LA11 (DQ274113) — -Brevibacteriaceae bacterium SM59 (DQ195870)
Firmicutes
Proteobacteria
0.1
Рис. 1. Филогенетическое дерево бактерий, выделенных из губки Stelletta tenui, построенное на основании последовательностей фрагментов 16S рДНК (около 600 нуклеотидов) с использованием алгоритма объединения ближайших соседей (neighbor-joining algorithm). Цифры у точек ветвления показывают статистическую достоверность порядка ветвления, определенную на основании бутстрэп-анализа (bootstrap analysis) 100 альтернативных деревьев. Масштабная метка соответствует 10 заменам на 100 нуклеотидов. В качестве внешнего репера использовали последовательность 16S рДНК штамма SM59, принадлежащего к семейству Brevibacteriaceae (номер в базе данных GenBank DQ195870).
pH 8.2, 18 мМ MgCl2, 500 мМ KCl, 0.1% глицерина, 1% Triton X-100) - 9 мкл; 10 мМ dNTP - 2 мкл; исследуемая ДНК - 1 мкл; Pfu ДНК-полимераза - 2.5 U; бидистиллированная вода - до 50 мкл. Протокол ПЦР был следующим: 5 мин денатурация при 94°C; выдержка при 80°C (на этой стадии вносили Pfu ДНК-полимеразу); 30 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК при 94°C, 1 мин отжига прайме-ров при 56°C и 2 мин элонгации ДНК при 72°C; и затем заключительная элонгация - 2 мин при 72°C. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Секвенирование осуществляли на приборе ABI3730 DNA Sequencer (США) с использованием праймера 27f. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с использованием программы BLAST. Выравнивание последовательностей 16S рДНК осуществляли с помощью программы CLUSTALX; для построения филогенетического дерева ис-
пользовали алгоритм объединения ближайших соседей (neighbor-joining algorithm) в программе Mega III. Показатели статистической достоверности порядка ветвления определяли на основании бутстр-эп-анализа (bootstrap analysis) 100 альтернативных деревьев.
Было получено 399 бактериальных изолятов. Из них выраженную антибактериальную и энзи-матическую активность проявляли 13 изолятов из S. tenui, 42 изолята из H. rugosa и 20 изолятов из D. avara. Данные по 33 репрезентативным изоля-там приведены в табл. 1. Многие изоляты (A75, A72, B81, B15, C123 и др.) обладали широким спектром антимикробной активности. Изоляты A05, A64 и B81 проявляли активность в отношении E. coli. Некоторые изоляты обладали разнообразными энзиматическими активностями (например, протеазной, липазной, агаразной, хити-назной). В частности, высокой протеазной и липазной активностями обладал штамм C117.
Таблица 1. Антимикробная и энзиматическая активность бактерий, выделенных из губок
Антимикробная активность Энзиматические активности
Штамм E. соН 5". aureus В. suЫШs Р. Аивесет С. аШсат А. niger Р. variotii проте-азная липазная хити-назная агараз-ная
A05 ++ - - - +++ - ++ + - - -
A06 - - + - - - ++ + - + -
A08 - - +++ - + - ++ + - - -
A09 - - ++ - ++ - - - + - -
A11 - - ++ - + + + - + - -
A18 - - ++ - - + ++ - + - -
A32 - - - - - ++ - + - - -
A45 - - - - - - ++ + - - +
A64 ++ - - - ++ - ++ + - - +
A71 - - - - ++ ++ ++ - + - -
A72 - - +++ - + ++ ++ - + - -
A75 - +++ +++ + + ++ +++ + + - -
A77 - - - - ++ - - + - - -
B02 - + - - - - - + + - +
B04 - + - - - ++ - + + - -
B05 - +++ + - - - - - + + +
B12 - + - + - + - - - - -
B14 - + + - - + - + + - +
B15 - +++ - + - +++ - + + - -
B18 - - - - - +++ - + + - +
B31 - + + - - + - + + - +
B61 - - - + - - - + - - -
B81 +++ +++ +++ +++ - - - - - - -
B118 - ++ - - - - - - - - -
C77 - - - - - ++ + ++ + - +
C89 - - - - - ++ + ++ ++ - -
C93 ++ ++ - -
ап - + - +++ - - + +++ - + +
014 - + - + - - ++ +++ - - -
017 - + - - - + ++ +++ +++ - -
023 - + + +++ - - + +++ + - -
030 - - - ++ - - + ++ - + -
Примечание. "-" - нет активности; "+" - низкая активность; "++" - умеренная активность; "+++" - высокая активность.
Таблица 2. Анализ с помощью программы BLAST последовательностей 16S рДНК бактерий, выделенных из губок
Штаммы Номера в GenBank Наиболее родственные штаммы и их номера в GenBank Сходство,%
A05 DQ091002 Alcaligenes sp. L981 (AY371437) 99
A06 DQ274111 Acinetobacter johnsonii штамм S35 (AB099655) 99
A08 DQ091003 Bacillus sp. штамм SSA3 (AB017587) 100
A09 DQ274112 Bacillus firmus (X60616) 99
A11 DQ274113 Alcaligenes faecalis (AB091759) 97
A18 DQ274114 Alcaligenes faecalis (AB091759) 99
A32 DQ274115 Staphylococcus epidermidis изолят CV64 (AJ717377) 100
A45 DQ274116 Bacillus sporothermodurans (U49080) 95
A64 DQ274117 Bacillus sporothermodurans (U49080) 98
A71 DQ274118 Bacillus cereus штамм J-1 (AY305275) 100
A72 DQ180141 Alcaligenes sp. IS-17 (AY346138) 98
A75 DQ091004 Staphylococcus lentus штамм SSH39 (AB219154) 100
A77 DQ274119 Bacillus cereus штамм J-1 (AY305275) 98
B02 DQ277980 Bacillus sp. Con a/4 (AJ784845) 100
B04 DQ277981 Bacillus licheniformis штамм CICC10181 (AY842871) 99
B05 DQ277982 Bacillus licheniformis ATCC 14580 (CP000002) 99
B12 DQ277983 Providencia sp. OP1 (AM040495) 100
B14 DQ277984 Bacillus sp. XL-2004 (AY788910) 100
B15 DQ277985 Bacillus sp. IIPON4 (DQ188943) 100
B18 DQ277986 Bacillus subtilis штамм MO2 (AY553095) 100
B31 DQ277987 Bacillus anthracis штамм ATCC 4229 (AY920253) 100
B61 DQ277988 Bacillus sp. MI-23a1 (DQ180948) 100
B81 DQ277989 Alcaligenes sp. IS-18 (AY346137) 100
B118 DQ277990 Bacillus sp. AI-15
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.