БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2004, том 30, № 4, с. 341-349
УДК 577.152.342*153.02
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФРАГМЕНТОВ АТР-ЗАВИСИМОЙ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИЗА © 2004 г. О. В. Васильева, Н. Ю. Мартынова, Н. А. Потапенко, Т. В. Овчинникова"
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 19.05.2003 г. Принята к печати 20.06.2003 г.
С целью исследования свойств функциональных доменов Lon-протеиназы Escherichia coli подобраны условия ограниченного протеолиза для получения фрагментов, примерно соответствующих доменам, разработан метод их выделения и проведен сравнительный анализ их функциональных характеристик. Показано, что изолированный протеолитический домен фермента (фрагмент LonP) обладает и пептидазной, и протеолитической активностями, однако скорость расщепления им крупных белковых субстратов существенно ниже, чем у полноразмерной Ьоп-протеиназы. Напротив, фрагмент LonAP, содержащий и АТР-азный, и протеолитический домены, почти полностью сохраняет ферментативные свойства полноразмерного белка. При этом оба фрагмента (LonP и LonAP) преимущественно образуют димеры, в отличие от нативной Lon-протеиназы, функционирующей в виде тетрамера. Полученные данные позволяют предположить, что /V-концевой домен Lon-протеиназы играет существенную роль в процессе олигомеризации фермента.
Ключевые слова: А TP-зависимые протеиназы, Ьоп-протеиназа Е. coli, ограниченный протеолиз, доменная структура.
ВВЕДЕНИЕ
Особую роль в поддержании гомеостаза и регуляции метаболизма в клетке играют олигомер-ные АТР-зависимые протеолитические комплексы, принадлежащие к семейству так называемых AAA-белков или АТР-аз, ассоциированных с различными активностями в клетке [1]. К настоящему времени в клетках Escherichia coli обнаружено пять различных АТР-зависимых протеиназ: Lon (La), ClpAP (Ti), ClpXP, FtsH (HflB) и HslVU (ClpQY) [2].
АТР-зависимая Lon-протеиназа, первая из описанных ААА-протеиназ Е. coli, представляет собой сериновую протеиназу с химотрипсинпо-добной активностью [3, 4]. Фермент функционирует в виде тетрамера, образованного идентичными субъединицами, содержащими по 784 а. о. (М 87304 Да) [5]. Предполагается, что мономер Lon-протеиназы состоит из трех функциональных доменов [6, 7]: /V-концевого, функция которого пока неизвестна, центрального АТР-азного, включающего участки, связывающие АТР и Mg2+, так называемые мотивы Уолкера А и В [8], а также
Сокращения: FPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография умеренного давления; ЭТТ - 1,4-дитио-0£-треит; ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование. #Автор для переписки (тел.: (095) 336-44-44; факс: (095) 336-4333; эл. почта: ovch@jbch.i-u).
С-концевого протеолитического, содержащего каталитически активный остаток Ser679 (рис. 1а) [9]. Наряду с этим был обнаружен участок Lon-npo-теиназы, ответственный за узнавание и связывание субстратов-мишеней фермента и названный субстратузнающим или SSD (sensor and substrate discrimination) доменом [10].
Согласно литературным данным, in vivo фермент проявляет селективность по отношению к двум типам субстратов. К первому типу относятся аномальные белки, образующиеся в результате ошибок транскрипции или трансляции, белки с третичной структурой, нарушенной в результате химического или теплового повреждения, а также чужеродные белки [6, 11, 12]. Ко второму типу относятся физиологические субстраты Lon-npo-теиназы, такие, как SulA, ^N-белок, RcsA, CcdA, Peml и UmuD - короткоживущие регуляторные белки, специфическое и быстрое расщепление которых важно для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки [13-19].
Специфичность Lon-протеиназы была исследована in vitro как для собственных физиологических субстратов (SulA, Ш-белок, CcdA), так и для модельных белков (глюкагон, окисленная В-цепь инсулина, казеин) [7, 14-17]. Однако механизмы узнавания субстрата и сопряжения АТР-азной и протеолитической активностей, а также другие
(а) АТР-зависимая Lon-протеиназа Е, coli. Предполагаемые границы доменов [7].
107
566
/V-концевон домен
АТР-азный домен
С-концевой протеолитический домен
(б) Ограниченный протеолиз: в отсутствие АТР
240
487
784
LonN
~L
LonP
в присутствии АТР
5 240 241
784
LonN
~L
(в)
LonAP
М, кДа
94
-Lon/WT
-LonAP
43 ¿ф ISR
30 ¿¿ф Ж1&'.' В - LonP
ш ш
- LonN
20
14
i
3
Рис. 1. Доменная структура Lon-протеиназы Е. coli. Предполагаемые границы доменов фермента [7] (а); схема результатов ограниченного протеолиза (б); SDS-электрофорез в 15% ПААГ продуктов ограниченного протеолиза Lon-npo-теиназы Е. coli (в) в отсутствие АТР (i) и в присутствии 4 мМ АТР (4); 1 - стандартная смесь белков-маркеров молекулярной массы для электрофореза; 2 - препарат Ьоп-протеиназы Е. coli.
структурно-функциональные особенности Ьоп-протеиназы пока еще детально не выяснены.
Ранее нами были подобраны условия ограниченного протеолиза Ьоп-протеиназы, при которых молекула фермента расщепляется с образованием крупных фрагментов, соответствующих ее функциональным доменам [20]. Целью настоящей работы являлось выделение и функциональная характеристика фрагментов АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Е. coli, полученных методом ограниченного протеолиза. Для решения поставленной задачи были использованы нативная Ьоп-протеиназа и ее мутантные формы, получены изолированные домены фермента и проведен сравнительный анализ их функциональных свойств.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами были найдены условия для ограниченного протеолиза нативной Ьоп-протеиназы (Lon/WT) протеиназой V8 из Staphylococcus aureus в отсутствие АТР с образованием /V-концевого
(LonN, 27 кДа) и С-концевого протеолитического (LonP, 33 кДа) доменов фермента [20]. Наряду с этим было показано, что ограниченный протеолиз Lon-протеиназы в присутствии АТР в аналогичных условиях приводит к образованию более крупного фрагмента полипептидной цепи (LonAP, 60 кДа), содержащего как АТР-азный, так и протеолитический домены, а также /V-концевого фрагмента (LonN, 27 кДа), идентичного образующемуся при гидролизе в отсутствие АТР (рис. 1). Аналогичные результаты были получены для му-тантных форм фермента, содержащих аминокислотную замену каталитически активного Ser679 на Ala (Lon/SA), приводящую к утрате пептидгид-ролазной активности, и/или имеющих дополнительный С-концевой гексагистидиновый участок (Lon/SA/H6, Lon/WT/H6) [20].
Для выделения фрагментов, полученных при ограниченном протеолизе нативной Lon-протеи-назы и ее мутантных форм, были использованы методы препаративного изоэлектрического фо~
М, кДа {а) LonP {б) L°nAP
94 ^
67 ^g^
пр. V8 -30 ^
14
■ i i :.....■ ' ■
20тт
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Рис. 2. SDS-электрофорез в 15% ПААГ последовательных фракций, полученных после разделения методом препаративного ИЭФ продуктов ограниченного протеолиза Ьоп-протеиназы Е. coli, проведенного в отсутствие АТР (а) и в присутствии 4 мМ АТР (б): 8-10 - LonP/WT; 16, 17 - LonAP/WT; 1, 11 - стандартная смесь белков-маркеров молекулярной массы для электрофореза.
кусирования в растворе, катионообменной и ме-талл-хелатной хроматографий.
С помощью препаративного изоэлектрическо-го фокусирования в растворе были выделены фрагменты LonP/WT и LonAP/WT из гидролизата нативной протеиназы Lon/WT, а также фрагменты LonP/SA и LonAP/SA из гидролизата мутант-ной формы фермента Lon/SA. Условия для разделения продуктов гидролиза были подобраны с помощью аналитического ИЭФ в ПААГ, исходя из теоретически рассчитанных изоэлектрических точек фрагментов, подлежащих разделению (LonP - р/ 7.51, LonAP - р/ 7.27, LonN - р/ 5.22). При этом учитывалось, что р/ протеиназы V8 из 5. aureus, использованной для ограниченного протеолиза фермента, составляет 4.91. При создании градиента в узком диапазоне рН от 6.0 до 7.2 удалось достичь хорошего разделения продуктов гидролиза. Препаративное ИЭФ было проведено в растворе в условиях, аналогичных аналитическому разделению. Полученные после препаративного ИЭФ фракции анализировали методом SDS-элект-рофореза в 15% ПААГ. При этом протеиназа V8 из S. aureus (р/ 4.91) и /V-концевой фрагмент Lon-протеиназы LonN (р/ 5.22), как и следовало ожидать, были обнаружены в первых фракциях, тогда как интересующие нас фрагменты LonP (р/ 7.51) и LonAP (р/ 7.27) фокусировались в более поздних фракциях (рис. 2а, б). Однако при этом искомые фрагменты, концентрируясь в области значений рН, близких к собственной изоэлектрической точке, частично выпадали в осадок, что существенно снижало их выход.
В качестве альтернативного метода разделения продуктов гидролиза Lon-протеиназы (нативной Lon/WT и мутантной Lon/SA) была использована ионообменная FPLC-хроматография. Были найдены условия хроматографического разделения на колонке HR5/5 с катионообменником Mono S (рис. За), при которых -95% белков выходили со свободным объемом колонки, а искомые
белки удерживались на колонке и затем элюиро-вались градиентом концентрации соли от 0 до 0.5 М NaCl. Степень чистоты выделенных этим методом фрагментов LonP и LonAP составляла не менее 99% (рис. 36).
Наряду с этим из мутантных форм фермента, имеющих дополнительные С-концевые гексагис-тидиновые участки (Lon/WT/Нб), методом ограниченного протеолиза в отсутствие и в присутствии АТР были получены и выделены фрагменты LonP/WT/Нб и LonAP/WT/Нб, соответствующие фрагментам LonP/WT и LonAP/WT нативного фермента. Разделение проводили с помощью металл-хе-латной хроматографии на Ni-NTA-агарозе по стандартной методике [21,22]. Контроль за разделением осуществляли с помощью SDS-электрофореза в 15% ПААГ (рис. 4).
Молекулярную массу и гомогенность выделенных фрагментов оценивали с помощью масе-спект-рометрии (рис. 5) и определения /V-концевой аминокислотной последовательности.
Сравнение эффективности методов, использованных для выделения искомых фрагментов Lon-протеиназы, свидетельствовало в пользу катионообменной хроматографии (табл. 1). Этот метод и был выбран для препаративного выделения
Таблица 1. Выход фрагментов Lon-пpoтeинaзы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.