БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 6, с. 839 - 847
УДК 577.152.1
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НИТРАТРЕДУКТАЗЫ ИЗ ГАЛОФИЛЬНОЙ СЕРУОКИСЛЯЮЩЕЙ БАКТЕРИИ Thioalkalivibrio nitratireducens
© 2010 г. А.А. Филимоненков, Р.А. Звягильская, Т.В. Тихонова*, В.О. Попов
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33; факс: (495)954-2732, электронная почта: ttikhonova@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 01.09.09 После доработки 28.10.09
Из растворимой фракции клеточного экстракта галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens (штамм ALEN 2) выделена и охарактеризована нитратредуктаза (НР). Фермент относится к классическим нитратредуктазам, содержащим молибденовый кофактор в активном центре и не менее одного железосер-ного кластера на субъединицу. Масс-спектрометрический анализ показал высокую гомологию НР с каталитической субъединицей NarG мембранной нитратредуктазы из умеренно галофильной бактерии Halomonas halodenitrificans. В растворе НР присутствовала в форме мономера с молекулярной массой 130—140 кДа и го-мотетрамера с массой около 600 кДа. Удельная нитратредуктазная активность фермента, составляющая 12 мкмоль/мин на мг белка, была максимальной при нейтральных значениях рН. Подобно другим мембранным нитратредуктазам фермент восстанавливал хлорат и его активность подавлялась цианидом и азидом. Термостабильность НР была выше, чем у большинства ферментов мезофильных организмов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Thioalkalivibrio nitratireducens, алкалофилы, нитратредуктаза, NarG.
Азот широко представлен в живых организмах. Степень окисления азота варьирует от +5 до —3, поэтому цикл азота в природе представляет собой сложный многостадийный процесс, включающий каскад окислительных (нитрификация) и восстановительных (денитрификация, диссимиляторная нитратредукция) реакций. Первая реакция восстановительного цикла катализируется нитратредуктазами (НР), осуществляющими двухэлектронное восстановление нитрата до нитрита [1, 2].
К настоящему времени у прокариот обнаружены три класса НР — ассимиляторные НР (Мае) и два класса диссимиляторных ферментов: дыхательные (респираторные) мембраносвязан-ные НР (Маг) и периплазматические НР (Мар).
Принятые сокращения: ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; КФБ — калий-фосфатный буфер; НР — нитратредуктаза; MGD — молибдопте-рингуаниндинуклеотид; Nap — периплазматические дис-симиляторные нитратредуктазы; Nar — дыхательные (респираторные) мембраносвязанные нитратредуктазы; NarGHI — мембраносвязанная нитратредуктаза, состоящая из субъединиц а, в, у; Nas — ассимиляторная нитратредуктаза.
* Адресат для корреспонденции.
Несмотря на разнообразие строения и различную локализацию в клетке, все известные НР содержат в своем активном центре молибденовый кофактор (Мо-со) в виде молибдоптерингу-аниндинуклеотида (МОО) [3, 4]. Помимо МОО, в состав нитратредуктазных комплексов входят различные простетические группы, включая Ре8-кластеры, цитохромы Ь и с, РАО, участвующие в переносе электронов от физиологического донора к активному центру фермента [2, 4, 5].
Ассимиляторные НР (Мае) локализованы в цитоплазме и являются растворимыми ферментами. Они могут быть ферредоксин (флаводоксин)-или МАОН-зависимыми. Ферредоксин-зависи-мая НР состоит из одной каталитической субъединицы (70—85 кДа) [6]. МАОН-зависимая НР является гетеродимером, содержащим каталитическую субъединицу (90—105 кДа) и субъединицу, ответственную за перенос электронов (45—50 кДа) [7]. Оба типа ферментов содержат МОО и Бе8-кластеры. Синтез ассимиляторной НР ингибиру-ется аммонием, не чувствителен к кислороду и индуцируется нитратом и нитритом [8, 9].
Дыхательные (респираторные) мембраносвя-занные НР (Маг) играют ключевую роль в фор-
мировании трансмембранного градиента протонов [4]. Nar состоит из трех субъединиц, а, в и у, причем а и в локализованы в цитоплазме, у-субъ-единица выполняет функцию мембранного якоря. Каталитическая а-субъединица (104—150 кДа) содержит молибденовый кофактор и кластер [4Fe—4S], в-субъединица (43—63 кДа) является глобулярным белком, содержащим железосер-ные кластеры [10], у-субъединица (19—28 кДа) содержит два гема ¿-типа. Для данного класса ферментов помимо восстановления нитратов характерно восстановление хлоратов и ингиби-рование цианидом и азидом. Синтез Nar может ингибироваться кислородом или быть к нему нечувствительным [11].
Периплазматические диссимиляторные НР (Nap) играют ключевую роль в аэробном и анаэробном обменах для усвоения следовых количеств нитрата и удаления избытка восстановительной энергии и не принимают участия в образовании трансмембранного потенциала. Эти ферменты локализованы в периплазме, являются гетеродимерами, состоящими из каталитической (90 кДа) субъединицы, содержащей молибденовый кофактор и кластер [4Fe—4S], и субъединицы с массой 13—19 кДа, содержащей два гема с. Nap-ферменты не используют хлорат в качестве субстрата, не чувствительны к инги-бированию цианидом и активируются в присутствии азида и тиоционата [11]. Синтез фермента может быть нечувствителен к действию кислорода и аммония, а также стимулироваться добавлением нитрата [12].
Бактерия Thioalkalivibrio nitratireducens (штамм ALEN 2) была выделена из донных отложений гиперсоленого содового озера Fazda (Wadi Natrun) в Египте. Она является галоалкалофи-лом с облигатно хемолитоавтотрофным типом метаболизма и способна к росту с сульфидом/полисульфидом и тиосульфатом в качестве доноров электронов аэробно и анаэробно за счет нитратредукции. В последнем случае нитрат количественно восстанавливается до нитрита [13]. Ранее из этого микроорганизма была выделена и охарактеризована октагемовая цито-хром с нитритредуктаза, существенно отличающаяся по структуре и свойствам от ранее описанных цитохром с нитритредуктаз. Фермент проявлял высокую активность in vitro и оказался чрезвычайно термостабильным [14, 15]. Возможно, уникальность свойств нитритредуктазы обусловлена адаптацией бактерии Tv. nitratireducens к экстремальным условиям обитания.
Целью данной работы было выделение и характеристика нитратредуктазы из бактерии Tv. nit-ratireducens ALEN 2, выращенной в условиях микроаэрофильной аэрации.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. Использованные в работе реактивы были произведены фирмой «Sigma» (США), «Merck» (Германия), «Aldrich» (США) или отечественного производства классификации о.с.ч.
Бактериальный штамм, условия выращивания и разрушения клеток. Штамм ALEN2 Tv. nitratireducens поддерживали как описано ранее [14]. Клетки выращивали при 28° в микроаэрофиль-ных условиях на минеральной среде, рН 10,0, содержавшей (г/л): Na2CO3 23; NaHCO3 7; NaCl 5; K2HPO4 1; KNO3 1; MgCl2 x 6H2O 0,2; набор микроэлементов [16]. В качестве источника энергии использовали 40 мМ тиосульфат. Ино-кулят выращивали в среде того же состава, дополненной 5 мМ NH4Cl, в 750 мл колбах (рабочий объем 500 мл) на роторной качалке (220 об/мин). Максимальная нитратредуктазная активность была выявлена в экспоненциально растущих клетках. Собранные на этой стадии роста клетки осаждали центрифугированием при 13 000 g в течение 30 мин и разрушали с помощью френч-пресса в 100 мМ калий-фосфатном буфере (КФБ), рН 7,0, с добавлением 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида — ингибитора сериновых протеаз. Неразрушенные клетки и клеточные стенки удаляли из гомогената центрифугированием при 13 000 g в течение 30 мин. Далее гомогенат разделяли на растворимую и мембранную фракцию с помощью ультрацентрифугирования при 150 000 g в течение полутора часов. Фракцию клеточных мембран дважды промывали 50 мМ КФБ, рН 7,0, мембранные белки солюбилизировали Triton X-100 (конечная концентрация 2%, v/v) в течение ночи при 4° и проверяли их на наличие нитрат- и нитритре-дуктазной активности с использованием стандартной процедуры, описанной ниже. Растворимую фракцию проверяли на наличие нитритредуктаз-ной активности с использованием той же процедуры. Нитратредуктазную активность контролировали окрашиванием в геле, так как присутствие высокой нитритредуктазной активности препятствовало количественному определению нитратредуктазной активности в растворе.
Выделение и очистка нитратредуктазы (НР). Для выделения НР использовали растворимую фракцию клеточного экстракта. Очистка фермента включала дробное высаливание сульфатом аммония, анионообменную хроматографию низкого давления, анионообменную ВЭЖХ и стадию гель-фильтрации.
Анионообменную хроматографию низкого давления проводили на колонке с DEAE-сефа-розой (Fast Flow) объемом 80 мл при 4° на хроматографе BioLogic LP фирмы «Bio-Rad» (США).
Колонка была предварительно уравновешена 50 мМ КФБ, pH 7,0. После нанесения экстракта и промывки колонки белок элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0—0,6 M в том же буфере. Собирали фракции объемом 7 мл. Выход НР контролировали по активности и ^280. Фракции, обладавшие нитратредуктазной активностью, были собраны, объединены, диали-зованы против 50 мМ КФБ, pH 7,0, и нанесены на колонку для повторной анионообменной хроматографии.
Высокоэффективную жидкостную анионо-обменную хроматографию проводили на хроматографе AKTA FPLC фирмы «Amersham Biosciences» (США) с использованием колонки MonoQ 10/100 GL, уравновешенной 50 мМ КФБ, pH 7,0. НР элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0—0,6 М в том же буфере.
Гель-фильтрационную хроматографию проводили на этом же хроматографе с использованием колонки Superdex™ 200 10/300, уравновешенной 50 мМ КФБ, pH 7,0, содержавшим 0,15 М NaCl.
Для определения молекулярной массы элю-ируемых белков использовали набор стандартных белков фирмы «Amersham Biosciences»: ти-реоглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), аль-долаза (158 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), химотрипсиноген (25 кДа), рибо-нуклеаза (13,5 кДа).
Для определения свободного объема колонки использовали декстран (2000 кДа).
Ds-Na-Электрофорез проводили в соответствии с методикой Лэммли [17], используя градиент ПААГ (5—20%). Белковые полосы окрашивали серебром по методу Нестеренко [18] и коллоидным Кумасси G-250. Для определения молекулярной массы использовали набор ре-комбинантных б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.