научная статья по теме ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА СЕМЕЙСТВА ЛАНТИБИОТИКОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА СЕМЕЙСТВА ЛАНТИБИОТИКОВ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 2, с. 228-238

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 579.222:576.32

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА СЕМЕЙСТВА ЛАНТИБИОТИКОВ

© 2010 г. В. П. Коробов*, Л. М. Лемкина*, Т. В. Полюдова*, В. К. Акименко**

*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь **Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 02.06.2009 г.

Изучены физико-химические и биологические свойства низкомолекулярного антибактериального пептида, выделенного из среды культивирования бактерий Staphylococcus warneri IEGM KL-1. Методами ультрафильтрации, ионообменной и обратнофазовой хроматографии пептид получен в гомогенном состоянии. В его составе обнаружено значительное количество остатков катионных и гидрофобных аминокислот, а также необычной аминокислоты лантионина. Молекулярная масса пептида равна 2999 Да. Бактерицидное действие выделенного пептида на клетки S. epidermidis 33 проявляется в широком диапазоне рН и полностью сохраняется после температурной обработки. По совокупности выявленных характеристик, происхождению и в соответствии с видовой принадлежностью продуцента пептид получил название варнерин. Имеющиеся данные позволяют рассматривать варнерин в качестве нового представителя семейства лантибиотиков — перспективных антибиотических агентов микробного происхождения.

Ключевые слова: низкомолекулярные катионные пептиды, антибактериальное действие, лантибиотики, Staphylococcus.

Бактерии являются продуцентами огромного количества различных биологически активных соединений. Особое внимание исследователей привлекают небольшие по размерам катионные пептиды, синтезируемые как грамположительными, так и грамотрицательными микроорганизмами [1, 2]. К настоящему времени охарактеризовано множество таких пептидов, обладающих выраженным антибактериальным действием, в основе которого лежит нарушение структурной организации мембран или поражение внутриклеточных мишеней с летальными последствиями [3].

Среди антибактериальных пептидов предметом интенсивного изучения являются низкомолекулярные бактериоцины, выделяемые некоторыми грам-положительными бактериями [4]. Они представляют собой пептиды с молекулярной массой порядка 1.5—5 кДа и характерными атипичными структурными свойствами — наличием в составе пептидных цепей дегидрированных остатков серина и треонина и редких тиоэфирных аминокислот — лантионина и 3-метиллантионина, благодаря которым в процессах посттрансляционной модификации формируются прочные внутримолекулярные кольцевые структуры. В составе этих необычных пептидов встречаются также лизиноаланин, D-аланин, лантионин-суль-фоксид, allo-изолейцин и другие редкие соединения [4]. Суммарный положительный заряд позволяет пептидным молекулам связываться с анионными

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: korobov@iegm.ru).

группировками клеточных оболочек бактерий. В то же время, избыток анионных зон на внутренней поверхности цитоплазматических мембран способствует дальнейшему продвижению пептидов — сорбции на внешней стороне мембран и внедрению в ли-пидный матрикс мембран с формированием нерегулируемых каналов и пор, что в итоге приводит к гибели атакованных клеток [5]. Имеющиеся данные указывают на способность пептидов облегчать поступление в бактериальные клетки различных биологически активных агентов, в частности, бэта-лактамов, ванкомицина и других антибиотиков, в результате чего значительно возрастает эффективность их действия на патогенные бактерии, в том числе, и антибиотикорезистентные штаммы [6, 7].

Следует отметить, что полувековое использование одного из пептидов этой группы — низина в качестве пищевого консерванта, не вызвавшее до настоящего времени появления и распространения резистентных к нему бактерий, объясняет растущий интерес к лантионинсодержащим пептидам, как к перспективным антибактериальным соединениям с широким диапазоном практического применения [8].

Ранее в процессе поиска продуцентов новых низкомолекулярных катионных антибактериальных соединений нами был выделен штамм грампо-ложительных кокков, секретирующий в среду культивирования низкомолекулярный антибактериальный фактор [9]. Целью работы явились его

выделение, очистка, характеристика физико-химических и биологических свойств. По представленным в настоящем сообщении данным, он может рассматриваться в качестве нового пептида семейства лантибиотиков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве продуцента антибактериального фактора (АБФ) использовали штамм Staphylococcus warneri IEGM KL-1 [10]. Индикаторным служил штамм Staphylococcus epidermidis 33, полученный из ГНИИСКМБП им. Л.А. Тарасевича (Москва).

Штамм S. warneri IEGM KL-1 выращивали на специальной обогащенной жидкой среде [11] в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл на термостати-руемом шейкере Certomat ("Sartorius", Германия) при перемешивании 150 об/мин и температуре 37°С. О росте культуры судили по изменению ее оптической плотности (OD600), которую измеряли на спектрофотометре PD-405 ("Apel", Япония). Бактерии культивировали до максимального уровня антибактериальной активности в среде роста. Для выделения АБФ клетки удаляли центрифугированием (20 мин, 4°С, 6000 g) на центрифуге Sigma 3K30, "Sartorius" (Германия), отбирали над осадочную жидкость и пропускали ее через мембранный фильтр Синпор ("Chemapol", Чехия) с диаметром пор 0.4 мкм. Фильтраты наносили на стеклянную колонку ЕС (25 х 500 мм, "BioRad", США), содержащую смолу Toyopearl-SP 650М ("Tosoh", Япония), предварительно уравновешенную 10 мМ Na-фос-фатным буфером, pH 7.2. Не связавшиеся с сорбентом компоненты фильтрата удаляли промыванием колонки этим же буфером в объеме, десятикратном по отношению к объему нанесенного супернатанта. С колонки АБФ элюировали линейным градиентом NaCl (0—0.5 М) в том же буфере со скоростью протока через колонку 2 мл/мин. Все фракции элюата тестировали на содержание в них антибактериальной активности, которую выявляли диффузионным методом, нанося аликвоты (5 мкл) каждой собранной фракции на плотную питательную среду LB, содержащую 0.8% агарозы ("Sigma", США) и клетки индикаторной культуры S. epidermidis 33 в количестве 106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Фракции элюата, содержащие антибактериальную активность, объединяли и подвергали обессоливанию на колонках PD-10-Sephadex™ G-25М ("Amersham Biosciences", Швеция). Наличие (отсутствие) в пробах NaCl после процедуры обессоливания определяли с помощью набора "Витал Диагностикс" (Россия) по прописи фирмы-изготовителя. Обессоленные фракции вновь тестировали на антибактериальную активность методом предельных разведений в иммунологических планшетах. В лунках планшета готовили ряд последовательных двукратных разведений исследуемых проб в жидкой среде LB без KCl, после чего в каждую лунку, содержащую

100 мкл среды LB с АБФ добавляли 10 мкл суспензии клеток S. epidermidis 33 (1.5—2 х 106 КОЕ/мл). Планшеты инкубировали в течение 16—18 ч при 37°С. Для повышения чувствительности измерения антибактериальной активности после окончания инкубации в лунки вносили по 10 мкл 1%-ного раствора 2,3,5-трифенилтетразолия ("BDH", Великобритания), и планшеты дополнительно инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин для прокрашивания бактериальных клеток в осадках формазаном. За условную единицу активности (ЕА) пептида принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдалось полное торможение роста тест-бактерий.

Обладающие антибактериальной активностью бессолевые элюаты объединяли, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали на установке Alpha-2 ("Christ", Германия).

Природу АБФ в полученных образцах устанавливали с помощью обработки различными гидролазами. Препарат ДНКазы ("Sigma", США) для подавления активности сопутствующих протеаз предварительно инкубировали при 37°С в течение 2 ч в буфере, содержащем 1.25 мМ фенилметансульфо-нилфторид ("Sigma", США), и вносили в пробу в количестве 36 Е/мл. Препарат РНКазы ("Reanal", Венгрия) предварительно прогревали при температуре 100°С в течение 15 мин для подавления активности сопутствующей ДНКазы, а затем, после медленного охлаждения до комнатной температуры для ренатурации, вносили в пробы в количестве 20 Е/мл. Для протеолитической обработки использовали протеиназу К ("Sigma", США) — 3 Е/мл, пепсин ("Calbiochem", США) - 500 Е/мл, трипсин ("Serva", Германия) — 35 Е/мл и карбоксипептидазу A ("Reanal", Венгрия) — 5 Е/мл. Субстратом служили препараты АБФ с известной антибактериальной активностью, к которым для создания необходимого для эн-зиматической реакции оптимума рН добавляли равные объемы буферных растворов: при изучении действия ДНКазы — 0.1 М CH3C00Na/0.1 М CH3COOH, 0.05 М MgCl2, рН 5.0; РНКазы — 0.1 М tris/0.1 М На, 0.15 М NaCl, рН 7.2; протеиназы К и карбоксипептидазы А — 0.05 М tris/0.05 М НО, рН 7.5; трипсина — 0.01 М tris/0.01 М На, рН 7.4; пепсина — 0.05 М НО. К каждой опытной пробе были поставлены две контрольных: первая содержала субстрат с буфером и 0.14 М раствор NaCl вместо фермента; вторая — фермент, буфер и воду вместо субстрата. Пробы инкубировали в течение 2 ч при 37°С, после чего отбирали аликвоты инкубационных сред и определяли в них антибактериальную активность.

Степень очистки выделенного ионообменной хроматографией препарата антибактериального пептида оценивали с помощью вертикального электрофореза в 12.5% полиакриламидном геле в rs-глициновом буфере с 0.1% Ds-Na, рН 8.3 по ме-

тоду Лэммли [12]. В качестве метчиков использовали набор маркеров для электрофореза Color Markers for SDS-PAGE ("Sigma", США).

Очистку образцов пептида до гомогенного состояния проводили хроматографией в обращенной фазе. Использовали градиентную систему 140 B и оптический детектор 785 A ("Applied Biosystems", США). Выделение пептида проводили на колонке BrownleeRP-Silica C18, 30 х 2.1 мм, 300 Â, размер частиц носителя 5 мкм ("PerkinElmer", США). Сосуд А: 0.1% трифторуксусная кислота ("PerkinElmer", Великобритания), сосуд Б: 70% ацетонитрил ("S

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком