УДК 577.152.313*2
По материалам доклада на VIРоссийском симпозиуме "Белки и пептиды (11—15 VI, 2013)"
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ ФИТАЗЫ БАЦИЛЛ
© 2013 г. А. И. Ахметова#, Ч. Нямсурэн, Н. П. Балабан, М. Р. Шарипова
Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, Кремлевская, 18 Поступила в редакцию 01.02.2013 г. Принята к печати 20.02.2013 г.
Впервые из клеточных лизатов рекомбинантного штамма Escherichia coli выделена и исследована фитаза Bacillusginsengihumi. Фермент очищен до гомогенного состояния, установлена его первичная структура. Сделано заключение, что фитаза относится к классу в-пропеллерных фосфатаз. Молекулярная масса белка составила 41 кДа, р1 4.8. Изучены некоторые физико-химические свойства фермента.
Ключевые слова: бациллы, фитаза, выделение, очистка, свойства.
Б01: 10.7868/80132342313040039
ВВЕДЕНИЕ
Недостаток фосфора в почве отражается на производительности сельскохозяйственных культур. Низкая его биодоступность для растений обусловленная образованием нерастворимых соединений — фитатов, является важной научно-практической проблемой [1]. Фитаты составляют около 50% от общего органического фосфора в почве и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения. Ферменты фитазы гидроли-зуют фитаты с образованием инозитола и доступных солей фосфорной кислоты [2]. Корни растений обладают слабой фитазной активностью и не секретируют фермент в ризосферу, поэтому растения не способны получать фосфор из фитатов почвы. Фитазы практически не вырабатываются в пищеварительном тракте свиней, птиц и других животных с однокамерным желудком. В условиях полного отсутствия фитаз фитаты, вместе с нерастворимым комплексом полезных питательных веществ, проходят желудочно-кишечный тракт транзитом. Это снижает доступность фосфора зерновых кормов и степень использования связанных с ним минералов. Запасы фосфатов на Земле — это невозобновляемые и исчерпаемые ресурсы. Поэтому необходимо искать альтернативные пути обеспечения сельскохозяйственных растений и животных фосфором.
Микробные фитазы, способные расщеплять почвенные нерастворимые фитаты, обладают вы-
# Автор для связи (тел.: +7 927 400-60-31; эл. почта: аКЬше-tova.alina@gmail.com).
соким практическим потенциалом и могут быть использованы для внесения в почву в качестве удобрения и как добавки в корма [3]. Фитазы катализируют последовательный гидролиз фитатов на менее фосфорилированные производные ино-зитола с сопутствующим высвобождением неорганического фосфата [4]. При добавлении фитаз нет необходимости в экзогенном внесении фосфора, что благоприятно влияет на окружающую среду [3]. Экспериментально установлено, что микробные фитазы, особенно в симбиотических растениях и животных, играют главную роль в минерализации органического фосфора [5].
Известны четыре класса фосфатаз, способных расщеплять фитаты: гистидиновые кислые фосфа-тазы (HAP), ß-пропеллерные фосфатазы (BPP), цистеиновые фосфатазы (CP), пурпурные кислые фосфатазы (PAP) [6]. Фитазы, продуциеруемые бациллами, относятся к классу ß-пропеллерных фосфатаз. В отличие от гистидиновых кислых фос-фатаз бациллярные фитазы не имеют гомологии ни с одной из групп описанных фосфатаз. Этот класс белков получил название благодаря молекулярной структуре, которая преимущественно состоит из ß-структурных элементов и напоминает шестилопастной пропеллер. У бациллярных фитаз отсутствуют консервативные участки активного центра RHGXRXP и HD, характерные для гистидиновых кислых фосфатаз [6].
Молекулы ß-пропеллерных фитаз содержат шесть кальцийсвязывающих сайтов. Связывание трех ионов кальция высокоспецифичными сайта-
Очистка фитазы B. ginsengihumi из клеточных лизатов рекомбинантного штамма E. coli
Стадия очистки V, мл Белок общий, мкг Общая активность, ед. акт. Удельная активность, ед./мкг Степень очистки Выход по активности, %
Клеточный экстракт 80 51200 19.2 0.0004 1 100
Аффинная хроматография 12 192 10.8 0.06 150 56.25
Хроматография на Q-сефарозе 2 62.5 3.5 0.056 140 18.2
Хроматография на колонке 0.7 9 1.75 0.2 500 9.1
SephadexG200
ми белковой глобулы приводит к увеличению ее термостабильности. Связывание трех дополнительных ионов кальция с низкоспецифичными кальцийсвязывающими сайтами на поверхности молекулы обеспечивает каталитическую активность фермента путем перехода одного конфор-мера в другой, предпочтительный для связывания с фитатом [7].
Цель работы состояла в выделении и очистке ß-пропеллерной фитазы Bacillus ginsengihumi из клеток рекомбинантного штамма, определение структуры и некоторых свойств белка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фитазу B. ginsengihumi выделяли из клеток рекомбинантного штамма E. coli Rosseta pET-LIC/Phy с помощью аффинной хроматографии на Ni-гранулах, ионообменной хроматографии на Q-сефарозе и гель-фильтрации на колонке Sephadex G200 16/60 в системе жидкостной хроматографии быстрого разрешения. Результаты очистки белка представлены в таблице. В результате трех стадий очистки клеточных лизатов нами получен препарат фитазы со степенью очистки, равной 500, и выходом по активности 9.1%. Отметим, что при очистке других бациллярных фитаз авторы использовали хроматографию на фенил сефарозе, DEAE-сефарозе, колонках MonoS, MonoQ [8—10]. Использованный нами прием аффинной хроматографии позволил получить хро-матографически гомогенный препарат фитазы из лизатов рекомбинантного штамма. Гомогенность очищенного фермента также установлена элек-трофоретически: в 12% ПААГ в присутствии до-децилсульфата натрия была получена только одна белковая полоса (рис. 1). Молекулярная масса белка составила 41 кДа.
Первичная структура очищенной фитазы B. ginsengihumi определена с помощью метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии (рис. 2). Установлено, что аминокислотная последовательность фитазы идентична полученной из последовательности нуклеотидов секвенированного нами гена фитазы
В. ginsengihumi. Последовательность аминокислот фитазы включала 371 а.о., что соответствовало молекулярной массе белка 41 кДа и подтверждало данные, полученные нами с помощью SDS-элек-трофореза. Молекулярная масса очищенного фермента была близка молекулярной массе внеклеточной фитазы В. subtilis (44 кДа) [2]. Изоэлектри-ческая точка фитазы В. ginsengihumi, установленная на основании структуры, составляет р1 4.8.
Анализ первичной структуры фитазы В. ginsen-gihumi показал наличие в молекуле белка шести
кДа 250 150 100
75
50 37
25 20
15
10
1 2
Рис. 1. ПААГ-8В8-электрофорез фитазы после очистки: белковый маркер молекулярных масс (1), фракция белка после всех стадий очистки (2).
Рис. 2. MALDI-TOF-масс-спектрометрия пептидов, полученных в результате обработки фитазы трипсином. Наложение коротких пептидов на основную аминокислотную последовательность фитазы, клонированную в рекомбинант-ный вектор.
[vTAHTt ГО WASüroftTOPAIWVHEK)
ш]
vtahtetdpvasüddaado
PAItfVHE КИРЕ KSK
| PVAMDDAADDPAIWHEKHPEK |[UTTW<K [
funwl
[sCLWYOLDGKQLHSfE fGKLWVCLR]
[süewyologkqihsveeük] f sglwydldgkJ
FVAWDDAADDPAIWVHEK
«NlYFQGYVNEEmFK
OOOKMENIYFQÜYVNEEWFK
I_I
I
i
QEHSYEFGK
PAIWHE KHPEK
PAIWHEK
[ KSGLWYDLD&KQIHSYEFÜK
g
| SEGKJfflEVYftlCHSDKw] | SEGI<MIEVW[XDt<)
YDFPLNGEKIDIAAASNR WEIEVYAIDGDKGKLK
YDFPLNGEK
NriEVYAIDGDKGK
D
IDIAAASNRSEGK
KSGLWYDLOGK
LMiVOLR
IDIAAASNR
SIIDPNH
WTIEVYAIDGDKI ГиЙ
DTOKMENLYFQGYVNE E Ш F KVTAHTETWVASGDDAATOPAimfHE KHPEKSKLITTNKKSGL WYDLDGKQL HSYEFGKL NNVDL RYD F PLNGEKIOIAAASNRSE GKMEIE VYAIDGDKGKL KSITDPNH
TGAFYAL VEGKQGE F EQYEIVDGGK
D
TGAFYALVEGK
IPNHPISTUISE VYGF SLYHSQKj
pnhpistnisevygf slyhsqkI
( QGE F EQYE IVDGGKGYVTGK ]
(qc.efeqye ivdggk 1
l NSQT E G L VADQEYtNL YIAE E DEAIMC
У
[ fnaepgggskgqwdr)
FNAEPGGGSK
GWTGK EF KLNSQTEG LVADDE YGJLY IAEEDEAIMt
i
ATGDHLTADIEGLTIYYAPNGK
[gyehwssq
5
1PNHPE STNISE VYGF SLYHSQKTGAF YAL VEGKQGE FEQYE EVDGGKGYVTGKKVRE F KLNSQTEG LVADOE YGN LY LAE E DEAIWKFNAE PGGGSKÖJVVDRATGBHLTADIEGL TIYYAPNGKGYLMASSQ
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
YVANFEITDGEK
YPYGIFVAQOGE NIONGQA VNQNFK
19 i
iSSQGNNSYAMYER NRYVANFEITDGEK
IVSWEQIAQH L GEWDLHKQVNPR
IDGTSDTDGIÜVEGFGLGPK
IVSWEQLAQHL GEWDLHK
i
D
LSSQGWISYAHYE RQGKNRYVANF EITDGE KIDGTSDTPGIOVLGF GLGPKYPYGIFVAQPGE NIDMGQAVNQHFKIV5WEQIAQHE GEhfDLHKQVNPRKL KDR5DGPGFS ]
0
260
360
270
290
310
330
340
350
консервативных сайтов связывания с кальцием, влияющих на термостабильность фермента (Ca1, Ca2, Ca3) и определяющих каталитическую активность белка (Ca4, Ca5, Ca6). В целом эти данные свидетельствуют, что выделенная нами фитаза B. ginsengihumi принадлежит к классу бациллярных ß-пропеллерных фитаз (рис. 3) [11]. По данным литературы [11] первый ион кальция связывается с четырьмя аминокислотными остатками в молекуле белка (Asp292, Asp325, Asn323, Ile324), второй ион кальция координирован с остатками Asp292, Asp320 и Glu322, третий - с Asp40, Pro41 и Val85. Остальные три иона кальция занимают сайты с меньшим родством. Четвертый ион кальция ответственен за каталитические свойства белка и координирован с четырьмя аминокислотными остатками: Asp39, Glu195, Asn83, Asn84, пятый ион каль-
ция связан с Glu211, Tyr143, Glu195, Glu244, шестой ион кальция связан с Glu244, Asp242, Gln263 (рис. 3).
При исследовании влияния температуры на активность фитазы B. ginsengihumi установлено, что температурный оптимум фермента соответствует 37°С (рис. 4); оптимум рН действия фитазы B. ginsengihumi соответствует рН 6.0 (рис. 5).
Изучение влияния ионов металлов на активность фермента показало, что ионы Co2+ и Ca2+ в концентрации 2 мМ повышают активность белка в среднем на 20% (рис. 6). Двухвалентные ионы Fe2+, Cu2+ и Zn2+ ингибируют активность фермента в концентрации соответствующих солей 2 мМ на 64, 60 и 75%, соответственно.
B.s. ------------rr^i-j-iz
B.a.-------------■■- ■■■::]~T-r. ~ :■ r--c-:
B.g. Ill MZi'LUvC "ГЛТ! I MM J MTiüiTI 11"T-Z С
■ ** * * - * -к it it * * * * *
DDP. iIHLDPKNFQNSKLI TTNK DDP. LIHLDPKNP QNSKLITTNff DD PAIWVHEKHP EK5KLITTNK * • * . *********
B.s. B.a. B.g.
it-к it it -kit it ш it it it it it it it it it it it it it ш it it
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.