УДК 577.11231.6.083
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА OmpF-ПОДОБНОГО ПОРИНА НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Yersinia ruckeri
© 2012 г. Д. К. Чистюлин*, О. Д. Новикова, О. Ю. Портнягина, В. А. Хоменко, Т. И. Вакорина, Н. Ю. Ким, М. П. Исаева, Г. Н. Лихацкая, Т. Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН, 690022, Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159; *электронная почта: cdk27@mail.ru Поступила в редакцию 23.09.2011 г.
Обнаружено, что температура культивирования Yersinia ruckeri, грамотрицательной бактерии, вызывающей иерсиниоз у рыб, влияет на полипептидный профиль фракции пориновых белков. Показано, что в "холодовом" варианте микроорганизма (при 4°С) экспрессируются преимущественно OmpF-подобные порины, а в "тепловом" (при 37°С) — OmpC-подобные белки. При комнатной температуре в наружной мембране Y. ruckeri присутствуют оба типа поринов. Из "холодового" варианта бактерии выделен и охарактеризован OmpF-подобный порин, определены его молекулярная масса и первичная структура. При помощи методов оптической спектроскопии (кругового дихроизма и собственной белковой флуоресценции) показано, что белок имеет пространственную структуру, типичную для в-структурированных поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий. С использованием техники бислойных липидных мембран (БЛМ) охарактеризована функциональная активность выделенного белка. Уровень наиболее вероятной проводимости канала составляет 320 ± 60 пСм, что соответствует проводимости OmpF-поринов иерсиний. Отличительной чертой OmpF-порина Y. ruckeri является его повышенная термоустойчивость в функционально активной конформации: белок образует стабильные поры в БЛМ даже после прогревания при 85°С.
Ключевые слова: грамотрицательные бактерии, Yersinia ruckeri, наружная мембрана, порообразую-щие белки.
Yersinia ruckeri — грамотрицательная бактерия, вызывающая у рыб иерсиниоз, известный как "энтерит, сопровождающийся покраснением рта" [1,2]. Иерсиниоз поражает в основном рыб семейства лососевых, у которых развивается заражение крови и возникают кровоизлияния на поверхности тела и внутренних органов [3]. Ежегодно Y. ruckeri является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Заболевание регистрируется в Прибалтийском регионе, в большинстве стран Восточной и Западной Европы, в США [4]. Несмотря на значимость проблемы, пока мало известно о механизмах патогенеза этого заболевания, что препятствует разработке превентивных мер эффективной борьбы с ним.
До настоящего времени основное внимание уделялось выявлению факторов патогенности Y. ruckeri, в том числе изучали металлозависимые протеазы [5—7], а также белки-инвазины [8]. Целый ряд подобных антигенов был включен в состав вакцинных препаратов, однако они оказались недостаточно эффективными [9].
Участие порообразующих белков наружной мембраны (НМ) в патогенезе инфекции, вызыва-
емой У. гыеквп, пока не рассматривалось. Однако полученные ранее результаты изучения поринов различных патогенных грамотрицательных бактерий, свидетельствуют о том, что эти белки являются высокоиммуногенными компонентами НМ иерсиний. Показано, что антитела к поринам обнаруживаются как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции [10]. Порины представляют собой мишени для системы врожденного иммунитета организма-хозяина, а также выступают в качестве эффекторов патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макрор-ганизме. Все это позволяет предполагать значимость поринов в процессе развития инфекции, в том числе и вызванной У. гыеквп.
Иерсинии обладают широкими адаптационными возможностями, что позволяет им существовать как в паразитическом, так и в сапрофитиче-ском состояниях [11]. Способность иерсиний выживать при пониженной температуре имеет эпидемиологическое значение, так как именно в этих условиях активируются некоторые факторы вирулентности [12]. Получены данные, свиде-
тельствующие о зависимости синтеза факторов вирулентности Y. ruckeri от температуры окружающей среды и других условий [7, 13]. Однако влияние условий культивирования Y. ruckeri на регуляцию синтеза порообразующих белков НМ изучено недостаточно. В связи с этим одной из задач нашей работы было изучение влияния температуры культивирования на регуляцию синтеза неспецифических поринов разного типа. Поскольку Y. ruckeri является патогеном холоднокровных организмов, роль температуры в переключении биосинтеза с одного типа поринов на другой вызывает особый интерес. Полученные данные помогут дополнить сведения о механизме этого явления, характерного для многих грамотрицатель-ных бактерий.
Настоящая работа посвящена изучению OmpF-подобного порина НМ Y. ruckeri, его пространственной структуры и функциональной активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование бактерий. В работе использовали штамм КММ 821 Y. ruckeri. Микроорганизмы культивировали в среде 2xYT при 4°С (в течение 3 сут), при 25°С (2 сут) и 37°С (1 сут). Затем культуру клеток центрифугировали при 5000 g и промывали осадок 30 мМ трис-НС1-буфером, pH 7.8 (буфер А).
Получение фракции пептидогликан-ассоцииро-ванных белков, выделение и очистка порина. Микробную массу обрабатывали 0.5% раствором сар-козилата натрия в течение 12 ч, затем центрифугировали в течение 5 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий белки цитоплазматической мембраны, удаляли. Осадок суспендировали в буфере А, содержащем 2% додецилсульфата натрия (SDS), перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g. Содержащийся в осадке комплекс пептидогликана (ПГ) с белками наружной мембраны (НМ) обрабатывали ДНКазой в течение 1 сут. Фракцию, содержащую ПГ-ассоцииро-ванные белки, экстрагировали в течение 1 ч буфером А, содержащим 1% SDS и 0.5 М №С1. Полипептидный состав фракций анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (ПААГ-SDS-электрофо-рез) [14].
Порин из "холодового" варианта Y. ruckeri очищали с помощью гель-хроматографии на Sephacryl S-300 HR (Pharmacia, Швеция) в буфере А, содержащем 0.25% SDS. Белки в геле окрашивали раствором Кумасси ярко-голубого G-250 в 3.5% хлорной кислоте [15]. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков (Fermentas, Литва) с молекулярными массами от 25 до
170 кДа. Присутствие липополисахарида выявляли, окрашивая гели ионами серебра [16]. Содержание моносахаридов в препаратах белка определяли стандартным методом [17]. Содержание белка в препаратах определяли согласно модифицированному методу Лоури в присутствии 2% SDS [18]. Получили препарат порина, содержащий 85% белка и не более 5% моносахаридов.
Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили в операционных средах Windows XP с использованием пакета прикладных программ Microsoft Exel. Достоверность результатов подтверждали, определяя стандартное отклонение (а) и стандартную ошибку (гах). Для n = 9 (9 измерений электрофоретической подвижности полипептидных зон) значение а равно 3.18, а mJÍ — 1.1 кДа.
ПЦР-амплификация. Нуклеотидные последовательности белоккодирующей части генов ompF и ompC Y. ruckeri штамм КММ 821 определены путем ПЦР-амплификации геномной ДНК с помощью праймеров, специфичных к гену ompF (FYR-For - 5'- GTAATCCCAGCATTGTTAGT-TGC-3', и FYR-Rev - 5'-TTAGAACTGATAAAC-CAAGCCAA-3'), к гену ompC (CYR-For - 5'-AT-TCCGGCCTTATTGGTAG-3' и CYR-Rev - 5'-TTA-GAACTGATAGACCATACCTACT- 3'). Праймеры конструировали с использованием программы Vector NTI8 (Invitrogen, США). ПЦР проводили в буфере объемом 25 мкл, включающем 1.5 мМ MgC12, 200 мкМ каждого dNTP, по 0.5 мкмоль прямого и обратного праймеров, 1.25 ед. Go-Taq-полимеразы и 50 нг ДНК-матрицы. ПЦР проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК - 95°С, 3 мин; 30 циклов - денатурация при 94°С, 20 с; отжиг при 58°С, 30 с; по-лимеразная реакция при 72°С, 1 мин; достройка ПЦР-фрагментов - 72°С, 7 мин. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ПЦР-фрагменты очищали с помощью коммерческого набора DNA Extraction Kit (Fermentas, Литва) и секвенировали на автоматическом ДНК анализаторе 3130XL (Applied Biosystems, США).
Спектроскопические методы исследования пространственной структуры белка. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Cecil CE 7200 (Англия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при ширине щели 1 нм. Поправку на светорассеяние раствора белка вводили, как описано в работе [19]. Удельный коэффициент поглощения А01%Д см порина принимали равным 1.00.
Спектры КД регистрировали на спектрополя-риметре Jasco-500А (Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 мм для пептидной и 1 см для ароматической областей спектра. В пептидной области спектра эллиптичность считали как эллиптичность среднего остатка, принимая сред-
нюю молекулярную массу аминокислотного остатка равной 110 Да, в единицах град • см2/дмоль по формуле:
[0] = бнабл • S X110/10 • c • l,
где S — чувствительность шкалы прибора, с — концентрация белка, мг/мл, l — длина оптического пути, мм.
В ароматической области спектра эллиптичность считали как молярную эллиптичность [0]М с молекулярной массой мономера порина, равной 38 кДа и тримера порина, равной 110 кДа. Калибровку спектрополяриметра проводили по 0.06% водному раствору аммониевой соли 10-суль-фоната-^-камфорной кислоты. Отношение эллип-тичностей полос при 191 и 290 нм составляло 2.05. Расчет элементов вторичной структуры выполняли с помощью пакета программ CD Pro [20].
Спектры флуоресценции поринов измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути, равной 1 см. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 280 и 296 нм. Спектры флуоресценции, корректированные по родамиду B (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буферного раствора. Спектральная ширина щелей монохрома-торов возбуждения и излучения составляла 5 нм. Разложение экспериментальных спектров на компоненты [21], соответствующие излучению спектральных форм оста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.