ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 4, с. 448-454
УДК 582.281
ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ УГЛЕВОДНОГО СОСТАВА
© 2011 г. Д. А. Андриянова*, Я. Э. Сергеева*, Г. А. Кочкина***, Л. А. Галанина*,
А. И. Усов**, Е. П. Феофилова*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 117312 ** Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, 119991 *** Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 e-mail: feofilov@inmi.host.ru, biolog1@migmail.ru Поступила в редакцию 23.11.2010 г.
Разработаны методы получения клеточных стенок (КС) для представителей мукоровых грибов и грибов аскомицетного аффинитета на стадии мицелия и покоящихся клеток — спор. Чистоту КС оценивали электронно-микроскопическим способом, специфическими методами окрашивания, контролем промывных вод, по наличию рибозы и дезоксирибозы, а также новым критерием — сравнение содержания хитина в целых клетках и КС грибов. Обсуждается значение предлагаемых методов получения чистых фракций КС и изучения их углеводного состава для хемосистематики мицелиальных грибов.
Клеточная стенка (КС) грибов впервые была описана в начале XVIII столетия, но длительное время практически не изучалась. В начале ХХ века началось ее интенсивное исследование, но в основном у растений и бактерий. Активное развитие грибоводства и биотехнологических производств, в которых в качестве продуцентов биологически активных веществ использовались мицелиальные грибы, сделали необходимым изучение КС грибов. Результаты исследований КС грибов до 80-х годов прошлого столетия были обобщены в работе [1]. В последующие годы были проведены основополагающие исследования, посвященные изучению химического состава КС, апикального роста и лизиса гиф, метаболизма хитина, антигрибных препаратов, гидрофо-бинов, ковалентно связанных белков, ферментов, участвующих в образовании КС, ветвления гиф и лизиса КС [2—12].
Изучение биологической функции КС и ее химического состава в значительной степени зависит от метода выделения этой структуры и определения степени чистоты фракции КС. Так, например, традиционно считалось, что в КС мицелия мукоровых грибов не содержится глюкан, а этот полисахарид характерен только для КС спор [13]. Однако в последние годы было показано, что у мукорового гриба Gongronella butleri USDB 0201 в мицелии присутствует хитозан-глюкановый комплекс [14]. Между тем, современная хемосистематика грибов рассматривает отсутствие глюкана у Mucorales как один из важнейших систематических признаков. Кроме того, наличие такого аминополисахарида как хитозан, традиционно рассматриваемого в качестве харак-
терного признака при определении мукоровых грибов, не установлено у грибов семейства Сипшп§-ИашеПасеае, в частности у СыптщНатеНа ]аротаа [15]. Возможно, что подобные различия в результатах исследований обусловлены методами выделения КС, которые должны обеспечить отсутствие трудно удаляемого цитоплазматического загрязнения во фракции КС.
Особенность предлагаемых в работе методов состоит в том, что они могут быть использованы на разных стадиях онтогенеза, в частности, на стадии активно растущего мицелия (трофофаза), стадии торможения ростовых процессов (идиофаза) и стадии перехода к образованию покоящихся клеток (спор). Использованные методы дают возможность получать чистые фракции КС грибов разных систематических групп как низших (мукоровые), так и анаморфных грибов аскомицетного аффинитета, а также таких мало изученных клеточных структур, как половые клетки Мисога1ез — зигоспоры.
Цель работы — разработка методов выделения КС мицелиальных грибов, проверка чистоты полученных фракций, а также изучение углеводного состава КС грибов на стадии мицелия и образования покоящихся клеток — спор.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. Работу проводили с ми-целиальными грибами, представителями низших грибов и анаморфных грибов аскомицетного аффинитета.
Исследовали гетероталличные штаммы Cun-ninghamella japonica (синоним — C. echinulata) ВКМ F-470(—), ВКМ F-471(+), ВКМ F-776(-), ВКМ F-775(+), ВКМ F-626(-), ВКМ F-1204(-), C. ho-motalica ВКМ F-930 (семейство Cunninghamellaceae) и Absidia coerulea ВКМ F-858 (+) и ВКМ F-859 (-), (семейство Mucoraceae), оба семейства входят в порядок Mucorales [16]. Для более подробного изучения были отобраны штаммы C. japonica ВКМ F-1204(—) и Absidia coerulea ВКМ F-859 (-).
Из анаморфных грибов аскомицетного аффинитета исследовали Penicillium roqueforti ВКМ F-3057 (отдел Ascomycota, класс Eurotiomycetes, порядок Eurotiales, семейство Trichocomaceae).
Все штаммы получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Кроме этих штаммов, использовали также гетероталличные штаммы Blakeslea trispora Т(+) и Т(-) и Aspergillus niger из коллекции ИНМИ РАН.
Методы культивирования. Для получения максимального количества спор и интенсификации процесса спорообразования в условиях твердофазного культивирования использовали посев в матрацах на агаризованные среды (2%): картофельную, карто-фельно-морковную, с суслом (7° по Баллингу), овсяную, 25%-ную глицерин-нитратную, кукурузно-соевую, c молочной сывороткой, Чапека, Чапека с добавлением дрожжевого экстракта и Чапека с добавлением 0.01% трегалозы. Для исследуемых грибов наиболее интенсивный процесс спорообразования наблюдался на сусло-агаре с добавлением трегалозы при температуре 27-28°С.
Зигоспоры мукоровых грибов получали на сусло-агаре в чашках Петри, для чего на поверхность среды наносили кусочки агаровой среды с выращенным 3-4-суточным мицелием (+) и (-) штаммов. В процессе роста при смыкании растущего поверхностного мицелия образовывалась темная полоса шириной 1.5-2.0 см, содержащая преимущественно зигоспоры.
Для глубинного культивирования грибов (27-28°С, 250 об/мин) использовали как естественные (с суслом, картофельно-морковная, кукурузно-сое-вая), так и синтетические (среда Гудвина с аспараги-ном и среда Гшаниной с нитратом аммония [17]) питательные среды. В качестве посевного материала использовали водную суспензию 10- 12-суточных спор, вносимых в колбу с питательной средой в количестве 3.0 х 106—3.9 х 106 спор/мл среды. Для анализа использовали мицелий в стадии трофофазы (40-48 ч) или идиофазы (70-75 ч).
Методы получения чистой фракции КС мицелия. Для получения КС отделенный от культуральной жидкости мицелий промывали водой и гомогенизировали 15 мин при 4°С (Homogenizer type HPW-324, Poland). Биомассу отфильтровывали на капроновом фильтре, отмывали водой и процедуру гомогениза-
ции повторяли. Отмытый вегетативный мицелий подвергали обработке ультразвуком (Ultrasonic disintegrator type UD-20 Techpan (Poland), 3 мин, 4°С, 22 кГц) с последующей длительной промывкой водой. Предварительно было установлено, что отмывка КС детергентом Na—ДДС или 8 М мочевиной, которые рекомендуются для удаления цитоплазма-тического загрязнения, может привести к разрушению КС и потере ряда соединений, в частности хитина. Для дальнейшего изучения углеводного состава КС мицелия, полученные КС обезжиривали, используя последовательную обработку смесью этанол—хлороформ (2 : 1 и 1 : 2) и затем либо обрабатывали диэтиловым эфиром, либо лиофилизировали и хранили при температуре 7—8°С в холодильнике.
Следует отметить, что разрушение КС и извлечение липидов у грибов, синтезирующих каротинои-ды, имеет свои особенности. В данном случае, для извлечения каротиноидов используется жидкий азот и диметилсульфоксид, после чего проводится экстракция метанолом и хлороформом [19].
Метод получения фракции спор и их КС. Для получения фракции спор грибов рода Cunninghamella споры смывали с поверхности 12-суточной культуры гриба, растущего на сусло-агаре в матрацах, водой, охлажденной до 4°С. Большее количество спор можно получить, предварительно измельчив в гомогенизаторе волокнообразный поверхностный мицелий, снятый с поверхности чашки Петри [20]. Для того, чтобы избежать прорастания спор эта процедура должна происходить максимально быстро, так как споры этих грибов обладают способностью прорастать в воде через 30—40 мин при температуре 27— 28°С. В то же время конидии P. roqueforti начинают прорастать в воде только через 23—26 ч, что облегчает условия работы со спорами этой культуры.
Отделение спор от остатков поверхностного мицелия проводили путем встряхивания на шейкере с последующим фильтрованием через капроновый фильтр. Контроль чистоты фракции спор осуществляли методом микроскопии. Осаждение чистой фракции спор грибов рода Cunninghamella проводили с помощью центрифугирования (Allegra, Beck-man Coulter (USA), 7500 g, 4°С, 35 мин). Конидии P. roqueforti гидрофобны, не осаждаются при центрифугировании и для их сбора лучше использовать фильтрование через матерчатый фильтр.
Для получения фракции КС полученные споры дважды замораживали жидким азотом, подвергали оттаиванию и обработке на аналоге пресса Хьюджа (метод твердого продавливания — экструзионная дезинтеграция, прибор Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН). Полученный после разрушения материал многократно промывали водой с последующим центрифугированием и обработкой жидким азотом. При необходимости после микроскопического контроля разрушенные споры отделяли от неразрушенных путем
дополнительного центрифугирования в 4.7 М растворе сахарозы (15 мин), затем фракцию КС подвергали обработке УЗ (5 мин) и центрифугировали. После промывки водой, КС обезжиривали для дальнейшего определения их углеводного состава.
Получение чистой фракции зигоспор и их КС. Для
отделения зигоспор мукоровых грибов темную полосу в центре чашки Петри вырезали с помощью скальпеля, поверхностный мицелий, содержащий в основном зигоспоры, пинцетом отделяли от агара и гомогенизировали с последующей промывкой на капроновом фильтре. Полученный материал подвергали действию УЗ (5 мин, 4°С) в водной среде. После микроскопического контроля разрушенный материал фильтровали через капроновое сито (размер пор около 300 мкм).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.