БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 399 - 411
УДК 577.112.083
ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА СТАБИЛЬНОГО ДЕФЕНСИН-ПОДОБНОГО ПРОТИВОГРИБКОВОГО ПЕПТИДА ИЗ СЕМЯН Trigonella foenum-graecum (ПАЖИТНИКА)
© 2015 Р. Оддепалли, Л. Гурупрасад*
Хайдарабадский Университет, химический факультет, Хайдарабад, 500046, Индия; электронная почта: lgpsc@uohyd.ernet.in
Поступила в редакцию 04.08.14 После доработки 27.10.14
Новый дефенсин-подобный противогрибковый пептид (Tf-AFP) с молекулярным весом 10,3 кДа был выделен из семян Trigonella foenum-graecum (пажитник) с использованием методов осаждения сульфатом аммония, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (RP-HPLC). Молекулярный вес очищенного пептида, определенный методом масс-спектрометрического анализа, оказался равным 10321,5 Да. Данный пептид проявлял высокое структурное сходство с растительными белками дефенсинами и другими противогрибковыми белками, обнаруженными при проведении поиска в базах данных. Двумерный электрофорез в ПААГ выявил pI = 8,8 и отсутствие изоформ. Полученный пептид Tf-AFP ингибировал рост различных видов грибов, таких как Fusarium oxysporum, Fusarium solani и Rhizoctonia solani. Противогрибковая активность подавлялась в присутствии 50 мМ NaCl. Методом кругового дихроизма было показано, что белок богат элементами ß-складчатой структуры и отличается высокой стабильностью в широком диапазоне температур. Интересно, что восстановление дисульфидных связей и денатурация химическими агентами не приводила к значительным изменениям вторичной структуры белка, что было подтверждено методами кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хроматографический метод, дефенсин-подобный противогрибковый пептид, MALDI-TOF-MS, биохимические и биофизические исследования, Trigonella foenum-graecum.
Растения вырабатывают большой набор антимикробных соединений для своей защиты от воздействия патогенов. Антимикробные пептиды представляют собой небольшие, преимущественно основные, богатые остатками цистеина пептиды размером 2—11 кДа, которые классифицируются в различные группы на основе их третичной структуры [1]. Антимикробные белки являются ключевыми компонентами врожденного иммунитета, представляющими древний защитный механизм, обнаруживаемый в разно-
Принятые сокращения: Tf-AFP — дефенсин-подоб-ный противогрибковый пептид из семян Trigonella foenum-graecum (пажитник), ПААГ — полиакриламидный гель, RP-HPLC — высокоэффективная жидкостная хроматография с обратной фазой, КД — круговой дихроизм, MALDI-TOF-MS — матрикс-ассоциированная лазерная десорбция-ионизация — времяпролетная масс-спектрометрия (matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry), ТФУ — трифторуксусная кислота, DTT — ди-тиотрейтол, GuHCl — гуанидин хлорид.
* Адресат для корреспонденции.
образных организмах. Экспрессия генов, кодирующих эти белки, предоставляет потенциальную возможность для разработки препаратов для защиты урожаев сельскохозяйственных растений. Исследования, направленные на разработку новых антимикробных препаратов, обеспечивают определение новых кандидатных генов с целью усиления устойчивости растений к болезням.
Огромное количество белков, различающихся по структуре и функциям, вырабатывается растениями для защиты от патогенов грибов. Это дефенсины; белки РЯ-1; (1,3)Р-глюканазы; циклофилин-подобный белок; белки, инакти-вирующие рибосому; белки, богатые остатками глицина и гистидина; киллерные белки (кил-лерные токсины); тауматин-подобные белки; ингибиторы протеаз; белки, переносящие липи-ды (ЕГР8); хитиназы; хитин-связывающие белки и др. Эти белки получили свои названия в связи с механизмом их действия, особенностями структуры или сходства с известным «типом»
белка [2]. Среди них дефенсины и дефенсин-по-добные белки представляют уникальное семейство антимикробных белков, характерное и для животных, и для растений.
Дефенсины и дефенсин-подобные растительные белки присутствуют в относительно больших количествах в тканях семян и защищают семена от почвенных грибков, тем самым повышая выживаемость проростков. Эти белки также были обнаружены и в других тканях растений. Дефенсины растений и дефенсин-по-добные белки демонстрируют разнообразные виды биологической активности in vitro: противогрибковую, антибактериальную, инсектицидную, антипролиферативную, ингибирование ферментов, блокирование ионных каналов и биосинтез белка [3]. Способ действия растительных дефенсинов широко изучался, однако молекулярный механизм их действия до сих пор не выяснен. Принято считать, что они вступают во взаимодействие с определенными сфинголи-пидами плазматической мембраны грибов и внедряются в фосфолипидный бислой мембраны, что вызывает пермеабилизацию и дестабилизацию мембраны. Для некоторых членов этого семейства белков было показано, что они проникают через мембрану в цитоплазму и взаимодействуют с внутриклеточными мишенями [4].
Пажитник является годичной травой, принадлежащей к семейству Fabaceae. Было показано, что его семена улучшают состояние при диабете, проявляют антиоксидантные свойства и контролируют уровень холестерина в крови [5]. В связи с экономической выгодой применения противогрибковых белков и пептидов в борьбе с грибковыми инфекциями, способными привести к массовому поражению сельскохозяйственных культур, целью настоящей работы являлись очистка и характеристика нового противогрибкового пептида из семян Trigonella foenum-graecum (пажитник) и определение группы противогрибковых белков, к которым он принадлежит.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. Семена пажитника были приобретены в местных условиях. В работе использовали хроматографические материалы и реактивы для проведения двумерного электрофореза в ПААГ («GE Healthcare», Великобритания), колонку Luna C18 HPLC («Phenomenex»), маркеры молекулярного веса для SDS-ПААГ-электрофо-реза («Fermentas», Германия; «Genetix», Индия), блок для ультрафильтрации и мембраны с исключением 3 кДа («Millipore», Индия), остальные
реактивы аналитической чистоты и отвечающие требованиям HPLC («Sigma-Aldrich», США).
Выделение и очистка противогрибкового пептида (Tf-AFP) из T. foenum-graecum. Семена T. foenum-graecum (100 г), свободные от шелухи, были измельчены, и мука была обезжирена промывкой гексаном с последующей промывкой четырьмя частями (w/v) смеси хлороформа и этанола (в соотношении 2 : 1) в течение 2 ч. Обезжиренную муку экстрагировали 25 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 6,5), содержавшим 50 мМ NaCl, 4 мМ ЭДТА и 0,01%-ный азид натрия, в соотношении 1 : 10 (w/v) в течение 36 ч при 4°. Гомоге-нат фильтровали через муслиновую ткань, фильтрат центрифугировали при 17 226 g в течение 20 мин при 4°. Полученный супернатант был обозначен как грубый экстракт. Образец грубого экстракта сперва осаждали добавлением сульфата аммония до 20%-ного насыщения. Образовавшийся супернатант доводили до насыщения сульфатом аммония при концентрации 70%. После центрифугирования при 17 226 g в течение 30 мин при 4° супернатант удаляли, осадок собирали и растворяли в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 6,2), диализовали против этого буфера с несколькими сменами буфера, используя диализные мембраны со значением исключающего веса 3,5 кДа (Spectra/Por6), и наносили на предварительно уравновешенную 20 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 6,2) XK 16/20 СМ-сефарозу для проведения быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC — Fast Protein Liquid Chromatography, AKTA Prime Plus, «GE Healthcare Life Sciences», Швеция). После элю-ции несвязывавшихся белков адсорбированные белки были элюированы линейным градиентом NaCl (0—1 М) в том же буфере при постоянной скорости элюции 0,4 мл/мин. Поглощение измеряли при 280 нм. Фракцию связавшихся белков (CM2), демонстрировавших противогрибковую активность, объединяли, подвергали диализу против 25 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,5) при 4° в течение ночи и концентрировали в блоке для ультрафильтрации с использованием мембраны с исключающей массой 3 кДа. Далее эту фракцию подвергали гель-фильтрации на колонке XK 16/100 с сефа-дексом G-50, предварительно уравновешенной 25 мМ натрий-фосфатным буфером (pH 6,5). Фракции (объемом 3 мл), относящиеся к пикам белков, объединяли при постоянной скорости 0,3 мл/мин, фракции (S3), демонстрирующие противогрибковую активность, объединяли, концентрировали и диализовали против 50 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержавшего 1 М (NH4)2SO4, и затем наносили на гидрофобную колонку XK 16/20 с октил-сефарозой
CL-4B, предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили градиентом буфера и (NH4)2SO4, pH 7,0 (10 мл 50 мМ буфера, 70 мл 50—15 мМ буфера). Фракции по 5 мл собирали при постоянной скорости 0,5 мл/мин. Фракции с высокой противогрибковой активностью (P1) подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (RP-HPLC — reverse-phase high performance liquid chromatography) на колонке C18 («Phenomenex», США; 10 x 250 мм, частицы 5 мкм, поры 100 А), используя систему HPLC («Shimadzu», Япония). Колонка предварительно была уравновешена 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислотой (ТФУ), затем элюция проводилась линейным градиентом ацетонитрила (0-30%-ным в течение 20 мин, 30-50%-ным в течение 40 мин, 50-70%-ным в течение 20 мин, 70-100%-ным в течение 1 мин) в 0,1%-ной ТФУ при постоянной скорости 2 мл/мин. Контроль элюции осуществляли измерением поглощения при 220 нм, пиковые фракции собирали вручную и диализовали против 20 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,5) с несколькими сменами буфера и затем использовали для проведения различных определений.
Определение белка, SDS-ПААГ и двумерный электрофорез (2D-PAGE). Концентрацию белка в образце определяли с помощью связывания с красителем [6], используя БСА в качестве стандарта. SDS-PAGE (15%-ный акриламид, 4%-ный метиленбисакриламид) был выполнен по методу Лэммли [7]. Полосы белков окрашивали 0,1%-ным раствором Coomassie Brilliant Blue R-250 или серебром [8]. Для определения значения pi очищенный препарат Tf-AFP
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.