УДК 547.9:577.1:575.224.46
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОМОЛОВОЙ КИСЛОТЫ
ИЗ снлмлешяюмлжтиюиим И оценка ее потенциальной
ГЕНОТОКСИЧНОСТИ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ
© 2014 г. Т. С. Фролова*, #, О. И. Сальникова**, Т. А. Дударева***, Т. П. Кукина**, О. И. Синицина***
*Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 **Институт органической химии СО РАН им. Н.Н. Ворожцова, Новосибирск ***Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Поступила в редакцию 27.03.2013 г. Принята к печати 20.05.2013 г.
Исследован состав липофильных компонентов, содержащихся в лекарственном растении иван-чай узколистный (Скатавпвпоп ащшй/оЫыт), на сырье трех лет сбора. Методом хроматомасс-спектро-метрического анализа впервые обнаружено 28 алифатических и 6 тритерпеновых кислот. С помощью теста Эймса и $0$-хромотеста показано, что помоловая кислота не обладает генотоксически-ми и мутагенными свойствами.
Ключевые слова: иван-чай узколистный, помоловая кислота, бактериальные тест-системы.
БОТ: 10.7868/80132342313060043
ВВЕДЕНИЕ
Растения традиционно являются наиболее интересным источником физиологически активных соединений. Основываясь на биосинтетических предшественниках, все природные соединения можно условно разделить на три основные группы: терпеноиды, алкалоиды и фенольные соединения. Наиболее подробно исследованы водо- и спирторастворимые алкалоиды и фенольные компоненты как основа препаратов народной и официнальной медицины [1].
Тритерпеноиды представляют обширную группу растительных веществ [2]. Их биоактивность в сочетании с низкой токсичностью вызвала повышенный интерес исследователей к этому классу соединений. Сейчас тритерпеноиды используются в лечебных целях во многих странах Азии как вещества, оказывающие противовоспалительное, обезболивающее, жаропонижающее, гепатопротекторное, кардиотоническое, успокаивающее и тонизирующее воздействие [3—5]. Недавние исследования не только подтвердили некоторые из вышеупомянутых фармакологических свойств тритерпеноидов, но и обнаружили ряд дополнительных активностей, включая анти-оксидантную, антимикробную, противовирус-
Сокращения: МТБЭ — метил-трет-бутиловый эфир. # Автор для связи (тел.: +7 (913) 769-86-60; эл. почта: &о1оуа@ bionet.nsc.ru).
ную, противоаллергическую, противозудную, ан-тиангиогенную и спазмолитическую [6, 7]. Обнаруживается все большее число тритерпеноидов, проявляющих цитотоксичность против ряда онко-трансформированных клеток и не являющихся при этом токсичными для нормальных клеток [8—10]. Тритерпеноиды демонстрируют также противоопухолевую эффективность на животных в доклинических моделях рака [8, 10]. Большое количество производных тритерпеноидов было синтезировано с использованием структурной модификации природных соединений для оптимизации их биологической активности, и некоторые из этих полусинтетических аналогов считаются наиболее мощными противовоспалительными и противораковыми агентами из всех известных на данный момент [11]. Противоопухолевая эффективность нескольких производных тритерпеноидов в настоящее время оценивается в фазе I клинических исследований [10].
Несмотря на многочисленные исследования пентациклических тритерпенов, все еще остаются белые пятна в изучении их биологической безопасности: многие соединения до сих пор не проверены на генотоксичность, цитотоксичность и мутагенность.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение состава фракции липофильных компонентов иван-чая узколистного Chamaenerion ап-gustifolium. В Западной Сибири имеется множество растений, в которых содержание тритерпеновых компонентов достаточно высоко. Одним из таких является иван-чай узколистный C. angustifolium (далее иван-чай) — широко распространенное по всему миру растение. При выращивании в условиях сибирской климатической зоны он накапливает за период вегетации значительную биомассу, поэтому может представлять интерес в качестве сырьевого источника биологически активных соединений, в частности тритерпеновых кислот. Сообщалось об обнаружении в составе его липофильной фракции урсоловой, олеаноловой, маслиновой и 2-а-гид-роксиурсоловой (коросоловой) кислот [12].
Для исследования липофильных компонентов иван-чая сырье заготавливали с 2008 по 2010 гг. дважды за период вегетации — в середине и конце вегетационного периода (июль и сентябрь соответственно). После высушивания сырье экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) для получения суммарного экстракта, из которого экстракцией водно-спиртовым раствором щелочи были получены фракции свободных кислот. Их качественный и количественный состав установлен хро-матомасс-спектрометрически [13].
Исследовался химический состав вегетативных и генеративных органов иван-чая. В генеративных органах, в отличие от вегетативных, содержание целевых тритерпеновых соединений было невелико, поэтому данные по ним не приведены. С помощью хроматомасс-спектрометриче-ского анализа (ХМС) в составе липофильной фракции иван-чая узколистного было впервые идентифицированы 28 алифатических кислот с длиной цепи от 10 до 30 атомов углерода: капри-новая, лауриновая, миристиновая, пентадекано-вая, пентадеценовая, пальмитолеиновая, маргариновая, у-линоленовая, нонадекановая, арахино-вая, генэйкозановая, бегеновая, трикозановая, тетракозановая, пентакозановая, гексакозановая, гептакозановая, октакозановая, нонакозановая, триаконтановая, 2-гидрокситрикозановая, 2-гид-рокситетракозановая, 2-гидроксигексакозановая, 2-гидроксиоктакозановая, 2-гидрокситриаконта-новая, гексадекандиовая, октадекандиовая, эйко-зандиовая и 6 тритерпеновых кислот: помоловая, урсоновая, олеаноновая, бетулиновая, ацетилур-соловая, ацетилолеаноловая.
Показано, что по содержанию экстрактивных веществ листья иван-чая узколистного превосходят стебли, и их содержание увеличивается в процессе вегетации (табл. 1). Итог по содержанию тритерпеновых кислот представлен в табл. 2. По содержанию урсоловой, олеаноловой и помоловой кислот иван-чай сопоставим с промышленными
Таблица 1. Выход экстрактивных веществ из сырья иван-чая узколистного сбора 2008—2010 гг. (% от веса воздушно-сухого сырья, среднее значение)
Образец сырья Выход экстрактивных веществ, % ± ст
июнь сентябрь
Листья 4.1 ± 0.1 5.7 ± 0.3
Стебли 0.7 ± 0.1 1.5 ± 0.3
Таблица 2. Содержание тритерпеновых кислот в сырье иван-чая узколистного (% от веса воздушно-сухого сырья)
Кислота/образец Листья Стебли
Июль Сентябрь Июль Сентябрь
Олеаноловая 0.11 0.125 0.017 0.035
Урсоловая 0.41 0.662 0.106 0.102
Урсоновая 0.012 0.003 0.002 0.025
Олеаноновая 0.004 0.001 0.001 0.019
Ацетилурсоловая 0.002 0.002 0.003 0.003
Ацетилолеаноловая 0 0.002 0 0.001
Помоловая 0.059 0.156 0.043 0.133
источниками наработки. Количественные данные получены с помощью ХМС-анализа (рис. 1, 2) [13].
Выделение и очистка помоловой кислоты. Одним из наиболее перспективных тритерпеновых соединений является помоловая кислота, проявившая свою активность во многих медико-биологических тестах [14—24].
Для помоловой кислоты обнаружены цитоток-сические свойства в отношении лимфоцитарных лейкозных клеток (линия Р-388), причем эффективная доза была сопоставима с действием офи-цинального препарата — 5-фторурацила [14]. Также для данного тритерпеноида была показана противовирусная (анти-ВИЧ) активность [15]. Обнаружено, что помоловая кислота способна тормозить рост культуры раковых клеток посредством активации АМР-зависимой протеинкиназы и ингибирования некоторых ключевых ферментов, участвующих в синтезе белка (р7086К и 4ЕВР1) [16].
Время, мин
Рис. 1. Хроматограмма тестируемого образца помо-ловой кислоты (чистота 95%).
Также возможен путь запуска апоптоза (активация каспаз) [17]. Имеются данные о противовоспалительном действии помоловой кислоты [17] и преодолении синдрома лекарственной резистентности [18]. В целом же тритерпеновые кислоты урсаново-го ряда, к которым относится помоловая кислота, обладают ангиопротекторными, антиоксидантны-ми, противовирусными, антибактериальными, ан-тиульцерогенными и иммуностимулирующими видами активности [19—23]. При этом в ряде тестов помоловая кислота была наиболее активной [24].
В данной работе источником помоловой кислоты являлись стебли иван-чая узколистного, в
Таблица 3. Генотоксичность помоловой кислоты
Соединение (концентрация, мМ) Дс)ср ± ст
Диметилсульфоксид 1
4-Нитрохинолин-1-оксид (1.6) 2.96 ± 0.43
Помоловая кислота (1) 1.09 ± 0.25
Помоловая кислота (10) 0.88 ± 0.08
которых ее содержание достаточно высоко. Выделение помоловой кислоты производилось согласно стандартной методике [25], очистка осуществлялась на хроматографической колонке с силикагелем. Дополнительно была проведена перекристаллизация помоловой кислоты из смеси гексана с диэтиловым эфиром. Выход составил 0.04% от веса воздушно-сухого сырья (чистота 95% согласно данным ХМС-анализа). Т. пл. очищенной помоловой кислоты (302— 303°С) и ее метилового эфира (127—129°C) совпадают с литературными [25, 26]. Также были записаны ЯМР-спектры (13С и 1H) для дополнительной идентификации полученного продукта (данные совпадают с литературными [14, 24, 25]). Эти образцы помоловой кислоты были использованы в последующих микробиологических тестах.
Помоловая кислота как потенциальный индуктор SOS-ответа. Многие соединения проявляют цитотоксический эффект, одним из механизмов подобного действия является остановка репликации при генерации повреждений в составе ДНК [27]. Для регистрации повреждений подобного рода и идентификации вызывающих их агентов разработан SOS-хромотест [28].
Для проверки генотоксических свойств (под ге-нотоксичностью подразумеваются любые повреждения молекулы ДНК, приводящие к блоку репликации) в SOS-хромотесте мы использовали штамм E. coli PQ37 (fA::Mud(Ap lac) cts, lacAU169, mal+, uvrA, galE, galY, PhoC, rfa) [28], позволяющий регистрировать подобные нарушения в структуре ДНК.
Многие соединения проявляют свои геноток-сические свойства после прохождения различных метаболических реакций, для регистрации этого был разработан SOS-хромотест с метаболической активацией тестируемых соединений микросо-мальными ферментами
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.