МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 375-378
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.2+579.8
ВЫДЕЛЕНИЕ С МУМИИ АНЮЙСКОГО БИЗОНА (BISON PRISCUS) ДИВЕРГЕНТНОГО ШТАММА ВИДА CANDIDA SAITOANA
© 2014 г. А. В. Качалкин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения
Поступила в редакцию 11.06.2013 г.
DOI: 10.7868/S0026365614030094
Дрожжевые грибы традиционно являются модельным объектом для исследования генетики эу-кариот. Благодаря сравнительно небольшому размеру группы, хорошей изученности отдельных видов, как по фенотипическим, так и по молеку-лярно-биологическим признакам, дрожжи являются также удобной моделью для разработки принципов филогенетической классификации и концепции вида.
Основные критерии для классификации видов у дрожжевых грибов формировались в направлении от морфологических признаков к физиологическим, современный же период, при учете всех накопленных знаний, связан с применением молекулярно-биологических методов, главным образом, анализа консервативных регионов рДНК. До последнего времени ориентиром для установления критерия филогенетического вида дрожжевых грибов был 1% различий в рибосо-мальных генах, конкретнее — в D1/D2 доменах 26S (LSU) рДНК [1]. Совсем недавно в качестве такого универсального ориентира для всего царства грибов был выбран другой регион рДНК — ITS [2]. Однако уже сейчас имеется большое количество данных, указывающих, что, например, для дрожжевых грибов эти два участка по отдельности не всегда "работают", и часто необходимо их совместное использование [3]. Кроме того, продолжаются дискуссии о необходимом уровне отличий по рибосомальным генам для видовой дифференциации [4]. Решение этой проблемы невозможно без учета всех возможных отклонений от типовых штаммов, которые хранятся в коллекциях в качестве неких эталонов. Обнаружение же генетических дивергентов дает возможность уточнить филогенетические границы видов, а также способствует развитию понимания, что филогенетический вид это не что-то дискретное, и всегда возможны небольшие отклонения, уровень которых предстоит изучить в будущем.
В 2012 г. в ходе проведения работ по изучению дрожжевых грибов, ассоциированных с мумией
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kachalkin_a@mail.ru).
плейстоценового бизона (Анюйский бизон), недавно найденной в вечной мерзлоте на Чукотке, был выделен штамм Candida saitoana VKPM Y-3988, существенно дивергировавший по нук-леотидным последовательностям рДНК, а также имеющий некоторые фенотипические особенности. Выделение штамма было произведено с шерсти, отобранной с поверхности туши. Идентификация проводилась анализом нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 доменов 26S (LSU) рДНК. Протоколы выделения ДНК, амплификации и секвенирования указаны в предыдущей работе [5]. Для филогенетического анализа полученных результатов применяли пакет программ MAFFT 6 [6] и MEGA4 [7]. Сиквенсы штаммов для построения филогенетического дерева были использованы из ген-банка NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базы данных CBS (cbs.knaw.nl). Нуклеотидная сеть была построена с использованием программы TCS1.21 [8]. Постановка физиологических тестов была выполнена согласно определителю [3]. Информация по физиологии штаммов для сравнения была взята из базы данных CBS и определителей [3, 9].
Проведенный филогенетический анализ с использованием метода нуклеотидных сетей на основании последовательностей D1/D2 доменов 26S (LSU) рДНК для штаммов, близких к выделенному по данным генбанка NCBI, показал, что для вида Candida saitoana уже было известно несколько генетических дивергентов, отличающихся на 1 п.н. от типового штамма (рис. 1). Выделенный же нами штамм является неизвестным ранее дивергентом вида, отличие которого от типового штамма составляет 2 п.н., что соизмеримо с различиями между видами C. saitoana и C. pseudoglae-bosa, самостоятельность которых была ранее подтверждена ДНК-ДНК реассоциацией [10].
Применение метода нуклеотидных сетей позволило ранее с успехом продемонстрировать наличие филогеографических группировок других видов аскомицетов по данным анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов 26S (LSU) рДНК [4]. Штаммы
376 КАЧАЛКИН
Рис. 1. Филогенетическая сеть (Parsimony network analysis) для штаммов, близких к C. saitoana VKPM Y-3988 по данным нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов 26S (LSU) рДНК. Каждая линия в соединении обозначает 1 замену в нуклеотидной последовательности, номер — положение замены. Типовые штаммы обозначены символом (T).
53 100
94
■LC
ы: J
Candida glaebosa CBS 5691 (FJ153208/U45757) Candidapseudoglaebosa CBS 6715 (CBS database/U71072) Candida saitoana CBS 940 (CBS database/U45762) 81L Candida saitoana VKPM Y-3988 (HG007840) Candidapalmioleophila CBS 7418 (EU568917/U45758) Candida fluviatilis CBS 6776 (CBS database/U45717)
62 '-Candida sphagnicola CBS 11774 (FN868154)
Scheffersomyces spartinae CBS 6059 (EU343815/U45764)
■c
10
Рис. 2. Филогенетическое положение (Maximum Parsimony analysis) штамма C. saitoana VKPM Y-3988 по данным нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов 26S (LSU) рДНК. Номера, данные над разветвлениями, соответствуют частоте (>50%) соединения таксонов при 1000 построений. Шкала показывает число замен.
С. заИвапа, нуклеотидные последовательности которых депонированы в генбанк МСВ1, происходят из Италии, Китая, России (Московская область и Чукотка), Финляндии и Японии. От типового штамма С. заИвапа и других конспецифичных ему на 1 п.н. отличаются штаммы из Китая (один из) и Финляндии, на 2 п.н. — штамм из Чукотки. Пока такая выборка не позволяет выявить в данной вариабельности некий филогеографический тренд, отражающий историко-географическую эволюцию вида, но при наличии такой вариабельности вид С. заЫвапа может быть перспективным объектом для подобного анализа.
Дополнительно проведенный филогенетический анализ по данным нуклеотидных последовательностей двух регионов рДНК: ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов 26S (LSU) показал, что выделенный штамм филогенетически близок именно к виду C. saitoana (рис. 2). Полученные результаты показали, что отличие между видами C. glaebosa и C. pseudoglaebosa составляет 9 замен в нуклеотидной последовательности, а между штаммами C. saitoana CBS 940T и C. saitoana VKPM Y-3988 — 5, что составляет около 0.5% отличий. Применение данных регионов рДНК для изучения популяционной вариабельности было использовано ранее для дрожжевых грибов рода
ВЫДЕЛЕНИЕ С МУМИИ АНЮЙСКОГО БИЗОНА (BISON PRISCUS)
377
Вариабельные ассимиляционные характеристики для вида C. saitoana по данным определителей [3, 9], данных CBS и результатов, полученных в ходе работы
1 2 3 4 5 6
Сорбоза + V + + + +
Целлобиоза - + + + + +
Лактоза - V + + - +
Мелибиоза - + + + V +
Рафиноза - + + + + +
Мелецитоза + V - - + -
Инулин - + - + - +
Крахмал - V - - - -
Е-Арабиноза - V + + + +
Б-Арабиноза - - - - V -
Рибоза - V + - + -
Глюкозамин - V - + + -
Глицерин + + + + + -
Эритрит - - - - + -
Рибит - + + + + +
Дульцит - - - - + +
Салицин - + + + + +
Молочная к-та + + - + + +
Лимонная к-та - + - + + +
Примечание. 1 — данные 2011 г. [3], 2 — данные 1998 г. [9], 3 — типовой штамм CBS 940 (данные CBS), 4 — штамм CBS 6729 (данные CBS), 5 — штамм CBS 8046 (данные CBS), 6 — штамм VKPM Y-3988.
Saccharomyces [11]. Так на основании полученных данных было показано, что существует географическая вариабельность штаммов S. cerevisiae, достигающая значений 0.35% вариабельности по участкам ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 доменам 26S (LSU) рДНК.
Фенотипическое различие видов C. glaebosa, C. pseudoglaebosa, C. saitoana, используя традиционные физиологические тесты, достаточно затруднительно [3, 10]. Кроме того, физиологическая характеристика вида C. saitoana постоянно пересматривается: так некоторые данные из определителя 1998 года несколько отличаются от данных, опубликованных в 2011 году, которые не согласуются и с данными для коллекционных штаммов (таблица). Однако при учете всего разнообразия известных варьирующих характеристик этого вида выделенный нами штамм имеет неиз-
вестную ранее особенность в виде неспособности к использованию глицерина в качестве источника углерода, что не было известно ранее для вида C. saitoana. Полученные данные по физиологии также интересны и для других видов клада C. glae-bosa, поскольку все они способны к ассимиляции глицерина [3, 12].
Таким образом, на примере штамма Candida saitoana VKPM Y-3988 показано, что изучение микроорганизмов из достаточно необычных местообитаний или неизученных территорий позволяет обнаружить неизвестные ранее филогенетические и фенотипические дивергенты хорошо известных видов. В свою очередь подобные находки способствуют решению фундаментальных вопросов, касающихся понимания объема всех вариа-бельностей, которые могут закладываться в понятия "вид" и "геновид" такой удобной модельной группы как дрожжи.
Автор благодарен Никольскому П.А. (ГИН РАН) и Шидловскому Ф.К. (музей "Ледниковый период") за предоставленную возможность изучить образцы с поверхности мумии. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-32230 мол_а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification and phylog-eny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences // An-tonie van Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 331-371.
2. Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., Chen W., and Fungal Bar-coding Consortium. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 6241-6246.
3. Kurtzman C.P., Fell J.W., Boekhout T., Eds. The Yeasts, a taxonomic study. 5th edn. Elsevier, 2011. 2080 p.
4. Lachance M.A., Dobson J., Wijayanayaka D.N., Smith A.M. The use of parsimony network analysis for the formal delineation of phylogenetic species of yeasts: Candida apicola, Candida azyma, and Candida parazyma sp. nov., cosmopolitan yeasts associated with floricolous i
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.