ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2008, том 63, № 1, с. 64-72
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ^
УДК 543.544
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ a-АМИНОКИСЛОТ НА СИЛИКАГЕЛЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ ЭРЕМОМИЦИНОМ
© 2008 г. М. А. Кузнецов*, П. Н. Нестеренко*, Г. Г. Васияров**, С. М. Староверов*' **
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы **ЗАО "БиоХимМак СТ" 119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 24.10.2006 г., после доработки 12.04.2007 г.
Изучено хроматографическое поведение энантиомеров a-аминокислот на новых хиральных неподвижных фазах на основе силикагеля с иммобилизованными на поверхности макроциклическим гликопептидным антибиотиком эремомицином и его агликоном. Получены зависимости удерживания сорбатов и энантиоселективности их разделения от структуры бокового радикала a-аминокис-лот, pH элюента, содержания органического модификатора в элюенте и температуры. Обсуждается механизм хирального распознавания энантиомеров a-аминокислот.
Разделение и определение оптических изомеров а-аминокислот является важной аналитической задачей разнообразных биохимических исследований. К настоящему времени наиболее распространенным методом определения оптической чистоты немодифицированных а-аминокислот является ВЭЖХ на неподвижных хиральных фазах (НХФ). В качестве селекторов в таких НХФ используют иммобилизованные комплексы а-аминокислот, циклодекстрины, краун-эфиры и др. Высокоселективным классом НХФ для прямого разделения энантиомеров а-аминокислот являются сорбенты с иммобилизованными макро-циклическими гликопептидными антибиотиками: ристомицином А [1-3], тейкопланином [4, 5] или их производными, такими, как, тейкопланин агликон [6] или продукты щелочного гидролиза ванкомици-на [7]. Особенностью макроциклических гликопеп-тидных антибиотиков является большое число центров распознавания в их молекулах и, как следствие этого, сложный характер закономерностей удерживания и распознавания энантиомеров аминокислот.
Целью настоящей работы явилось изучение хроматографических свойств новых сорбентов этого класса, содержащих в качестве хирального селектора отечественный макроциклический гли-копептидный антибиотик - эремомицин и его агликон при разделении энантиомеров а-амино-кислот различного строения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали хроматограф фирмы Киаиег (Германия) в составе: насос К-1001,
спектрофотометрический детектор К-2501, термостат колонок, кран-дозатор с объемом 20 мкл. Неподвижные хиральные фазы получали согласно методикам [8, 9]. Эремомицин получен на опытной установке в Институте по изысканию новых антибиотиков им Г.Ф. Гаузе [10, 11]. Эремо-заминилагликон эремомицина получали по методике [12]. Выход продукта составил 50%, а его чистота по данным ВЭЖХ - 87%. Хроматографиче-скую колонку из нержавеющей стали длиной 250 х 4 мм (ЗАО "БиоХимМак СТ") заполняли полученным сорбентом суспензионным методом при давлении 60 МПа. Регистрировали хроматограм-мы и обрабатывали результаты с помощью программно-аппаратного комплекса "Мультихром" (Амперсенд, Россия).
Реагенты. Для приготовления подвижной фазы (табл. 1) применяли хроматографически чистые ацетонитрил и метанол (Р1ика, Швейцария). В качестве буферных добавок использовали уксусную кислоту, ацетат аммония, триэтиламин (ТэА) (Р1ика, Швейцария). Порядок элюирования Ь- и Д-изомеров определяли по времени удерживания индивидуальных энантиомеров а-амино-кислот (81§ша-ЛЫпеИ, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В основу настоящего исследования положена обнаруженная недавно [9, 12, 13] неожиданно высокая энантиоселективность разделения изомеров аминокислот на сорбентах с иммобилизованным эремомицином (Э-8Ю2) и эремозаминилаглико-ном эремомицина (ЭА-8Ю2). Среди макроциклических гликопептидных антибиотиков наиболее
(а)
НОТ\нзС НО НО \\/ НО\
Н2^4-/СНз И.СН2ОН
НО
(б)
О С1
О ^ ^О.
О
ОН
НО
т^'УУгг
СН3
I 3
О СН3
О О
Н2^ „Г/СН3
НО
(в)
ОН НО ОН
ЧН3С НО 3 НО \ Н2МЦ^СН3 И СН2ОН
ОН ^ДО
Н3С ХО
МН2
СН3
С1
О
НО
О
О Н N
О
О Н О
О Н ОО Н Н,С.
СН3
I 3
ОН НО
№Н2
Н2С\^-СН3 СН3
ОН
^ОН С1
13 ^
НО
НО
О
О СН3
О
КН2
Н2С\^-СН3 СН3
ОН НО
Рис. 1. Химические структуры ванкомицина (а), эремомицина (б) и эремозаминилагликона эремомицина (в).
близким по структуре к эремомицину (рис. 16) является ванкомицин (рис. 1а), который при использовании в качестве хирального селектора НХФ не проявляет заметной селективности в разделении энантиомеров аминокислот [14]. В то же время Э-БЮ2 проявляет высокую энантиоселектив-
ность разделения при использовании широкого круга подвижных фаз (табл. 1). Энантиоселектив-ность разделения на НХФ с макроциклическими гликопептидными антибиотиками зависит от многих факторов, включая содержание метанола, природу и концентрацию буферного раствора,
Таблица 1. Состав элюентов, использованных для разделения изомеров аминокислот
Элюент Состав элюента
I 60% СН30Н-40% водного раствора СН3С00Н с рН 3.8
II 60% СН30Н-40% водного 1%-ного раствора ТЭАА с рН 4.1
III 85% СН30Н-15% водного 25 мМ раствора СН3С00Ш4
IV 20% СН30Н-80% водного 0.2%-ного раствора ТЭАА с рН 4.1
V 40% СН30Н-60% водного 0.2%-ного раствора ТЭАА с рН 4.1
VI 20% СН30Н-80% водного буфер 0.1М раствора КаИ2Р04
* ТЭАА - ацетат триэтиламмония.
рН элюента. В табл. 2 приведены результаты разделения ряда аминокислот на колонке Э-8102 в элюентах различного состава. Анализ полученных результатов показал, что концентрация буферного раствора слабо сказывается на энантио-селективности разделения, а изменение рН и содержания органического компонента в подвижной фазе заметно влияют на удерживание и селективность разделения. Типичные примеры разделения энантиомеров аминокислот на сорбентах Э-8Ю2 и ЭА-8102 представлены на рис. 2.
Влияние структуры исследуемых аминокислот на энантиоселективность разделения. Влияние структуры исследуемых аминокислот на энантиоселективность изучали для сорбента Э-8Ю2 при использовании смеси (1:1) метанола и воды в качестве элюента (табл. 3). Можно предположить, что удерживание и селективность разделения оптических изомеров в этих условиях определяются природой заместителя в боковой цепи а-амино-кислот. Тем не менее простое увеличение длины н-алкильного заместителя в боковой цепи в ряду аминокислот аланин < а-аминомасляная кислота < < норвалин < норлейцин не приводит к линейному изменению удерживания энантиомеров и селективности их разделения. Как видно из рис. 3, если удерживание Ь-изомеров аминокислот практически не меняется с увеличением длины и, соответственно, гидрофобности бокового алифатического радикала, то для Д-изомеров аминокислот и энантиоселективности разделения характерна куполообразная зависимость с максимумом для а-аминомасляной кислоты. Это свидетельствует о том, что гидрофобные ароматические кольца антибиотика не экспонированы на поверхности привитой молекулы, а, по-видимому, локализованы внутри молекулы, образуя гидрофобные "карманы". Размер такого "кармана" оптимален для молекул аминокислот с этильным заместителем в боковой цепи (а-аминомасляная кислота). Дальнейшее увеличение гидрофобного заместителя снижает удерживание Д-изомера и энантиоселективности. Такое снижение, по-видимому, можно объяснить возникающими стерическими препятствиями в гидрофобном "кармане" с ростом раз-
мера алифатического радикала. Наличие разветвленного углеводородного радикала в молекулах валина и лейцина способствует увеличению энантиоселективности по сравнению с норвали-ном и норлейцином, имеющими аналогичные радикалы, но нормального строения. Таким образом, удерживание гидрофобных аминокислот не описывается закономерностями обращенно-фазо-вого механизма. Существенно влияют стерические факторы соответствия размера бокового радикала аминокислоты размеру "кармана", расположенного рядом с центром хирального связывания аминокислот.
Для ароматических аминокислот (фенилгли-цин, фенилаланин, тирозин, 3,4-дигидроксипро-изводного фенилаланина) характерна еще более высокая энантиоселективность, связанная с дополнительным вкладом п-п-взаимодействий с ароматическими кольцами хирального селектора в распознавании изомеров. Отсутствие -СН2 группы между асимметричным атомом углерода и ароматическим кольцом (фенилглицин) приводит к снижению энантиоселективности, что может быть связано с менее благоприятной ориентацией ароматического кольца для реализации стереоспецифических взаимодействий с ароматическими кольцами хирального селектора.
Наличие гидроксильных групп в ароматическом ядре способствует росту селективности по сравнению с фенилаланином. При этом удерживание Ь-изомера для тирозина или 4-гидроксифенил-аланина не отличается от удерживания Ь-фенил-аланина, тогда как для 3,4-дигидроксипроизводно-го фенилаланина (ДОФА) наблюдается рост удерживания обоих изомеров. По-видимому, в этом случае также увеличивается вклад специфических неселективных взаимодействий вне центра хирального распознавания аминокислот эре-момицина, что несколько снижает энантиоселек-тивность.
Введение полярной группы в боковой алифатический радикал существенно влияет на удерживание как Ь-, так и Д-изомеров аминокислот. Различные функциональные группы в боковом радикале аминокислоты по-разному влияют на
Таблица 2. Результаты хроматографического разделения рацематов аминокислот на колонке Э-8Ю2
Аминокислота Подвижная фаза кь кэ а
Триптофан I 0.54 1.26 2.33 4.78
II 0.76 1.39 1.83 4.35
III 0.72 1.34 1.86 4.13
IV 1.19 2.27 1.91 6.02
V 0.92 1.73 1.88 5.17
VI 2.47 4.28 1.73 4.86
л-Фтор-тирозин I 0.29 0.90 3.10 4.02
II 0.40 0.82 2.05 3.05
III 0.45 0.83 1.84 2.36
IV 0.44 1.08 2.45 3.25
V 0.39 0.92 2.36 3.78
VI 0.84 2.61 3.11 6.87
Фенилаланин I 0.34 1.24 3.65 5.88
II 0.40 0.98 2.45 4.43
III 0.63 1.34 2.12 3.23
IV 0.37 1.06 2.86 6.17
V 0.37 1.01 2.73 4.48
VI 0.55 2.38 4.33 6.64
(2-Тиенил)аланин I 0.56 1.35 2.41 6.26
II 0.50 1.03 2.06 4.85
III 1.07 1.80 1.68 3.24
IV 0.44 1.06 2.41 6.63
V 0.45 1.04 2.31 6.09
VI 0.93 2.56 2.75 9.50
Метионин I 0.33 0.5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.