ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 11, с. 1201-1207
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 636.085.3:577.18:543
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ-ВРЕМЯПРОЛЕТНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ В ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИБИОТИКОВ ПЕНИЦИЛЛИНОВОЙ И ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУПП В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ © 2015 г. В. Г. Амелин*, **, 1, А. И. Коротков**, ***
*Федеральный центр охраны здоровья животных 600901 Владимир, мкр. Юрьевец **Владимирский государственный университет им. Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых 600000 Владимир, ул. Горького, 87 1Е-таИ: amelinvg@mail.ru ***Брянская межобластная ветеринарная лаборатория 241520 Брянская обл., с. Супонево, ул. Шоссейная,7 Поступила в редакцию 25.01.2015 г., после доработки 07.05.2015 г.
Предложен способ идентификации и определения 27 антибиотиков пенициллиновой (15) и тетрацик-линовой (12) групп в пищевых продуктах методом времяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией и простой экспрессной про-боподготовкой. Диапазон определяемых содержаний пенициллинов составил 3 (50)—300 (1000) мкг/кг, тетрациклинов — 0.3 (1.5)—100 (200) мкг/кг. Предложена схема идентификации и определения антибиотиков методом стандартной добавки. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0.1. Продолжительность скрининга пробы 30—40 мин, определения обнаруженных антибиотиков 2—3 ч.
Ключевые слова: антибиотики пенициллиновой и тетрациклиновой групп, пищевые продукты, высокоэффективная жидкостная хроматография, времяпролетная масс-спектрометрия высокого разрешения.
Б01: 10.7868/8004445021511002Х
Антибиотики пенициллиновой и тетрациклиновой групп широко применяют в ветеринарии, поэтому их остаточные количества могут встречаться в пищевых продуктах животного происхождения. В соответствии с приложением 7 к техническому регламенту Таможенного Союза "О безопасности пищевой продукции" максимально допустимые уровни (МДУ) ампициллина, амок-сициллина в молоке не должны превышать 0.004 мг/кг, в мясе, рыбе, печени и почках — 0.05 мг/кг, клоксациллина, диклоксациллина, нафциллина и оксациллина в молоке — 0.03 мг/кг, в мясе, рыбе, печени и почках — 0.3 мг/кг [1], антибиотиков тетрациклиновой группы — отсутствие или не более 0.01 мг/кг [2].
В настоящее время остаточные количества пе-нициллинов в пищевых продуктах определяют методами ВЭЖХ с ультрафиолетовым [3—5], ди-одно-матричным [6] и масс-спектрометрическим
[7—10] детекторами. Тетрациклины определяют в основном методом ВЭЖХ с диодно-матричным [10, 11] и масс-спектрометрическим [12, 13] детекторами. В предложенных методиках для извлечения антибиотиков из пищевых продуктов используют экстракцию органическими растворителями или буферными растворами, а затем проводят очистку и концентрирование экстракта методами твердофазной [3—5, 7, 8, 13, 14] или дисперсионной твердофазной экстракцией [6, 9, 10]. Однако данные способы длительны, трудоемки, неэкономичны и в большинстве случаев требуют концентрирования экстракта для достижения МДУ. Кроме того, эпиформы тетрациклинов, как правило, не определяют, но, как отмечено в работе [15], содержание их в пищевых продуктах может быть достаточно велико. Следует отметить, что методики одновременного определения остаточных количеств пенициллинов и тетрациклинов отсутствуют.
6
1201
В данной работе рассмотрено сочетание простой и быстрой пробоподготовки с одновременной идентификацией и чувствительным определением пенициллинов, тетрациклинов и их эпиформ в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии—времяпролет-ной масс-спектрометрии высокого разрешения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали жидкостной хроматограф UltiMate 3000 (Thermo Scientific, США) в сочетании с квадруполь-времяпролетными масс-спектрометрическим детектором maXis Impact (Bruker Daltonics, Германия). Разделение проводили на колонке (150 х 2.1 мм) Acclaim™ 120 C18 (2.2 мкм) (Thermo Scientific, США) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы.
Реактивы. Использовали стандартные образцы пенициллинов и тетрациклинов с содержанием основного вещества не менее 95—98% (Fluka, Sigma и Dr. Ehrenstorfer, Германия). Исходные стандартные растворы (1 мг/мл) готовили растворением навески препаратов в метаноле или ацето-нитриле. Рабочие растворы готовили разбавлением исходных деионированной водой. Использовали метанол, ацетонитрил, муравьиную кислоту, н-гек-сан, изопропанол (Merck, Германия).
Условия хроматографического разделения и детектирования. Использовали подвижную фазу, состоящую из 0.1%-ной НСООН в воде с добавлением 5 мМ HTOONH4 (А) и 0.1%-ной HCOOH в аце-тонитриле (В) и градиентное элюирование: 0 мин 2% В, 15 мин 100% В, 20 мин 100% В, 25 мин 2% В. Скорость потока подвижной фазы 0.3 мл/мин. Температура хроматографической колонки 40° С, объем вводимой пробы 20 мкл.
Использовали электрораспылительную ионизацию в устройстве ionBooster (Bruker Daltonics, Германия). Установлены следующие оптимальные параметры: напряжение на распылительном щите 400 В, на капилляре 1000 В, давление газа-распылителя 4.76 атм, поток газа-осушителя азота 6 л/мин, температура газа-осушителя азота 200°С, поток газа-испарителя азота 250 л/ч, температура газа-испарителя азота 250°C.
Диапазон регистрируемых масс ионов 300— 600 Да. В качестве градуирующего вещества использовали 10 мМ HCOoNa в водном растворе изопропанола (1 : 1). Градуировку проводили в автоматическом режиме при регистрации положительных ионов в диапазоне от 3 до 4 мин и при регистрации отрицательных ионов от 17 до 18 мин.
Пробоподготовка. Молоко и жидкие молочные продукты. В центрифужную пробирку емк. 50 мл помещали 10.0 г молочного продукта, добавляли 10 мл ацетонитрила, 0.3 г ЭДТА и 0.1 мл НСООН. Пробирку интенсивно встряхивали 5 мин и цен-
трифугировали 10 мин при 5000 об/мин при —4°C. Отбирали 3 мл верхнего слоя в центрифужную пробирку емк. 15 мл, добавляли 2 мл гексана (насыщенного ацетонитрилом) и встряхивали
2 мин. После расслоения фаз отбирали 2 мл нижней фазы в пенициллиновый флакон, добавляли 1 мл деионированной воды, перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр (0.45 мкм) в микрофлакон, отбросив первый 1 мл фильтрата, и хрома-тографировали.
Твердые молочные продукты (сухое молоко, творог, сыры и пр.). К навеске измельченного продукта 1.00 г, помещенного в пробирку емк. 15 мл, добавляли 2 мл деионированной воды, перемешивали 5—10 мин и выдерживали 20 мин, добавляли 0.5 мл 20%-ной трифторуксусной или трихлорук-сусной кислот, 0.05 г ЭДТА, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин при —4°C. Центрифугат переносили в другую пробирку, добавляли 1 мл гексана, встряхивали 1—2 мин, после расслоения фаз отбирали нижний слой, разбавляли его в 2 раза, фильтровали в микрофлакон и хроматогра-фировали.
Мясо, жир, яйца, печень, почки. Навеску измельченного продукта 1.00 г помещали в пробирку емк. 15 мл, добавляли 2 мл деионированной воды и
3 мл ацетонитрила, встряхивали 8—10 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин при —4°C. Центрифугат (3 мл) переносили в другую пробирку, добавляли 2 мл гексана, насыщенного ацетонитри-лом, и встряхивали 1—2 мин. После расслоения фаз отбирали 2 мл нижней фазы в пенициллино-вый флакон, добавляли 2 мл деионированной воды, перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр (0.45 мкм) в микрофлакон, отбросив первый 1 мл фильтрата, и хроматографировали.
Идентификацию и определение антибиотиков проводили с использованием программного продукта TargetAnalysis-1.3 (Bruker Daltonics, Германия), обработку хроматограмм по общему ионному току и масс-хроматограмм — с использованием DataAnalysis-4.1 (Bruker Daltonics, Германия), составление картины изотопного распределения в аналите — с использованием IsotopePattern (Bruk-er Daltonics, Германия).
Идентифицированные антибиотики определяли методом стандартной добавки. Концентрацию аналита в пробе рассчитывали по формуле:
сх = " сдоб/(1Х + доб/1),
где сх, сдоб — концентрации аналита без добавки и с добавкой аналита; 1х, 1х+доб — площади (высоты) хроматографических пиков (пиков m/z) аналита без добавки и с добавкой аналита.
Таблица 1. Основные характеристики пенициллинов и тетрациклинов, определяемых методом масс-спектро-метрии высокого разрешения (А, млн-1 — погрешность измерения масс ионов)
Аналит
Брутто-формула Ион ^R, мин Масса моноизотопа m/z А, млн-1 с ^мин' нг/мл
сш
нг/мл
Тетрациклины
4- Эпидемеклоциклин C21H21ClN2O8 [М + Н]+ 8.0 465.1059 0.2 0.1 0.5
4-Эпидоксициклин C22H24N2O8 [М + Н]+ 8.6 445.1605 -0.2 0.2 0.7
4-Эпиокситетрациклин C22H24N2O9 [М + Н]+ 7.2 461.1554 1.1 0.5 1
4-Эпитетрациклин C22H24N2O8 [М + Н]+ 7.5 445.1605 -0.2 0.5 1
4-Эпихлортетрациклин C22H23ClN2Os [М + Н]+ 8.5 479.1215 -0.4 0.5 1
Ангидротетрациклин C22H22N2O7 [М + Н]+ 9.6 427.1499 6.5 0.5 1
Демеклоциклин C21H21ClN2O8 [М + Н]+ 8.4 465.1059 0.2 0.1 0.5
Доксициклин C22H24N2O8 [М + Н]+ 9.0 445.1605 -0.2 0.2 0.7
Метациклин C22H22N2O8 [М + Н]+ 8.9 443.1448 -0.2 0.1 0.5
Окситетрациклин C22H24N2O9 [М + Н]+ 7.6 461.1554 1.0 0.5 1
Тетрациклин C22H24N2O8 [М + Н]+ 7.9 445.1605 -0.2 0.5 1
Хлортетрациклин C^ClNA [М + Н]+ 8.9 479.1215 -0.4 0.5 1
Пенициллины
Амоксициллин C16H19N3O5S [М + Н]+ 5.2 366.1118 3.2 0.5 1
Ампициллин C16H19N3O4S [М + Н]+ 6.8 350.1169 -1.1 0.5 1
Бакампициллин C21H27N3O7S [М + Н]+ 10.3 466.1642 -2.8 0.1 0.4
Диклоксациллин C19H17Cl2N3O5S [М - Н]- 12.8 468.0182 2.8 1 3
Карбенициллин C17H18N2O6S [М + Н]+ 6.8 379.0958 -2.3 2 5
Клоксациллин C19H18ClN3O5S [М - Н]- 11.9 434.0572 8.7 0.5 2
Нафциллин C21H22N2O5S [М + Н]+ 12.2 415.1322 -1.9 0.2 0.7
Нафциллин C21H22N2O5S [М - Н]- 12.2 413.1165 3.6
Оксациллин C19H19N3O5S [М - Н]- 11.6 400.0962 6.6 1 3
Пенициллин G C16H18N2O4S [М + Н]+ 7.3 335.1060 -0.9 0.5 1
Пенициллин V C16H18N2O5S [М - Н]- 11.2 349.0853 6.3 0.5 1
Пивампициллин C22H29N3O6S [М + Н]+ 11.0 464.1849 -3.4 0.05 0.2
Пиперациллин C23H27N5O7S [M - H]- 10.0 516.1547 0.8 0.5 1
Султамициллин C25H30N4O9S2 [М + Н]+ 9.7 595.1527 -2.5 2 5
Тикарцилли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.