УДК 571.27,577.29
ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫЙ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК DARPin-mCherry ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ КЛЕТОК, ГИПЕРЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ОНКОМАРКЕР HER2/neu
© 2014 К.Е. Миронова12*, О.Н. Черных13, А.В. Рябова4, О.А. Стремовский1, Г.М. Прошкина1, С.М. Деев1,2
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва; факс: +7(495)335-0812, электронная почта: office@ibch.ru, kgobova@gmail.com
2 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950 Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва 4 Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 38; факс: +7(499)135-0270
Поступила в редакцию 20.07.14 После доработки 03.09.14
Предложен простой и надежный способ детекции онкомаркера НБЯ2/пеи на поверхности опухолевых клеток с использованием адресного флуоресцентного гибридного белка ВАКРт-шСИеггу. В качестве адресного модуля, способного с высокой селективностью узнавать внеклеточный домен эпидермального фактора роста НБЯ2/пеи, использован белок ВАКРт9-29, принадлежащий к новому классу нацеливающих молекул неиммуноглобулиновой природы; в качестве детектирующего модуля применен красный флуоресцентный белок шСИеггу. Гибридный белок ВАКРт-шСИеггу получен с высоким выходом в бактериальной системе экспрессии, очищен из растворимой фракции в одну стадию с помощью аффинной хроматографии; полученный белок не склонен к агрегации. С помощью методов конфокальной микроскопии, проточной ци-тофлуориметрии и поверхностного плазмонного резонанса доказана специфичность связывания белка ВАКРт-шСИеггу с онкомаркером НБЯ2/пеи. Константа диссоциации комплекса белка ВАКРт-шСИеггу с рецептором НБЯ2/пеи, определенная методом поверхностного плазмонного резонанса, составила 4,5 нМ. Вышеперечисленные характеристики гибридного белка ВАКРт-шСИеггу позволяют рассматривать его в качестве перспективного агента для иммунофлуоресцентного анализа и альтернативы используемым для этой цели антителам и их фрагментам, меченным флуоресцентными красителями.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: БАЯИп, шСИеггу, онкомаркер НБЯ2/пеи.
Современные методы изучения связывания лигандов (в том числе новых терапевтических противоопухолевых соединений) с поверхностными клеточными рецепторами и их последующей интернализации, как правило, основаны на конъюгации антител, специфичных к этим рецепторам, с флуоресцентными красителями или радиометками. Мы предлагаем простой и надежный способ визуализации поверхностных клеточных антигенов опухолевых клеток с использованием красного флуоресцентного гибридного белка ВАКРт-шСИеггу на примере линии клеток аденокарциномы молочной железы
* Адресат для корреспонденции.
человека. Данная линия клеток характеризуется повышенным уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu, который относится к семейству рецепторов эпидермального фактора роста HER 1—4 и гиперэкспрессируется также клетками рака яичников, легких, желудка, простаты и других видов рака [1]. Механизм канцерогенеза заключается в неконтролируемом формировании гомо- и гетеродимеров HER2/neu, что способствует повышению пролиферации и миграции клеток, торможению апоптоза, неоангиоге-незу и в конечном итоге приводит к формированию опухоли и метастазированию [2, 3]. Поэтому у женщин с положительным HER2/neu-ста-тусом рака молочной железы заболевание носит,
1698
во-первых, более агрессивный характер, а во-вторых, чаще сопровождается рецидивами по сравнению с НЕК2/пеи-отрицательными случаями. Опухолевый маркер НЕЯ2/пеи — один из наиболее изученных белков такого рода [4—6], однако функции НЕЯ2/пеи как протоонкогена, механизм интернализации, а также передача сигнала внутри клетки в настоящее время изучены не полностью. Более того, НЕЯ2/пеи — единственный член семейства, лиганды которого также не установлены [2]. Таким образом, изучение интернализации НЕЯ2/пеи исключительно важно для выяснения его роли в путях передачи сигнала в клетке. И поскольку НЕЯ2/пеи является значимой мишенью для создания новых противоопухолевых соединений (на основе наночастиц, лентивирусов и пр.), их взаимодействие с клетками также требует фундаментального изучения.
В настоящей работе в качестве альтернативы антителам и их фрагментам, меченными низкомолекулярными флуоресцентными красителями или радионуклидами, для исследования поверхностных опухолевых маркеров предложено использовать химически и оптически стабильный гибридный белок постоянного состава, включающий флуоресцентный белок дальне-красного спектра эмиссии шСИеггу и адресный полипептид БАЯРт неиммуноглобулиновой природы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение генетической конструкции DARP-mCherry. Кодирующая последовательность DARPin9-29 была амплифицирована на матрице плазмиды pCG-Hnse-DARPin-d18-9-29 (любезно предоставлена проф. A. Плюктуном, Университет г. Цюрих) с использованием специфических праймеров 5'-tattccatatggacctgggtaagaaactg и 5'-cgccgaattcttgcaggatttcagccag. Полученный фрагмент ДНК был обработан эндонуклеазами рестрикции NdeI и EcoRI (сайты узнавания рест-риктаз подчеркнуты в структуре праймеров) и лигирован с вектором pET22b(+), который предварительно был обработан теми же рестриктаза-ми. После трансформации лигазной смесью клеток E. coli штамма XL1-Blue и отбора трансформантов, содержащих вставку, была получена плазмида pDARP9-29. Кодирующую последовательность гена mCherry с гибким шарниропо-добным линкером PKPSTPPGSS с помощью рестриктаз EcoRI и HindIII выщепляли из плазмиды pIG6-4D5scFv-mCherry, полученной в нашей лаборатории ранее, и лигировали с плазми-дой pDARP9-29, обработанной теми же рест-
риктазами. В полученной плазмиде pDARP-mCherry целевой ген находится под контролем индуцибельного промотора фага Т7 и содержит в одной рамке считывания кодирующие последовательности генов DARPin9-29 и mCherry, а также гекса-гистидиновую метку в З'-концевой части.
Выделение рекомбинантного белка DARPin-mCherry. Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pDARP-mCherry. Единичную колонию засевали в 2 мл среды YTPS (1%-ный триптон, 1%-ный дрожжевой экстракт, 45 мМ K2HPO4, 5 мМ KH2PO4, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2) с 0,1 г/л ампициллина и растили в течение ночи при 37° с аэрацией. Затем ночную культуру разбавляли в 50 раз средой YTPS и далее культивировали в тех же условиях до средне-логарифмической фазы (OD600 -0,5—0,7), температуру культивации понижали до 25° и добавляли изопропилтиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ. Индукцию проводили в течение 8 ч. После этого клетки охлаждали и осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин при 4°. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере (200 мМ NaCl, 30 мМ NaH2PO4, 2 мМ Tris, pH 8,3), клетки разрушали на ледяной бане с помощью ультразвукового дезинтегратора (продолжительность ультразвуковой обработки 5—7 раз по 45 с). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15 000 g в течение 30 мин. Супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и наносили на колонку Ni2+-NTA Sepharose («GE Healthcare Life Sciences», Великобритания) согласно протоколу производителя. Белки, не связавшиеся с сорбентом, удаляли при промывании колонки буфером Т2 (2 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 30 мМ NaH2PO4, pH 8,3). Связавшиеся белки элюировали буфером Т2 с 150 мМ имида-золом. Выход очищенного белка составил 40 мг/л культуры.
Анализ очищенного белка DARPin-mCherry проводили в 12%-ном денатурирующем полиак-риламидном геле.
Определение константы связывания белка DARPin-mCherry с рецептором HER2/neu. Константу диссоциации комплекса белка DARPin-mCherry c внеклеточным доменом рецептора HER2/neu определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore («GE Healthcare Life Sciences»). Сенсорные чипы СМ-5 покрывали рекомбинантным антигеном p185HER-2-ECD с плотностью 4500 резонансных единиц. Константу диссоциации рассчитывали исходя из полученной сенсограммы, используя программу BIAevaluation 3.0 («GE Healthcare Life Sciences»).
Конфокальная микроскопия. Клеточные линии SKBR-3 и CHO культивировали в среде RPMI-1640 («Thermo Scientific», Россия) c 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой («Thermo Scientific») в культуральных флаконах. Для экспериментов по определению связывания белка DARPin-mCherry с рецептором HER2/neu клетки в концентрации 15 000/мл высевали в конфокальные чашки со стеклянным дном («WillCo Well», Нидерланды) и растили в течение ночи при 37° в атмосфере 5%-ной СО2. Перед экспериментом к клеткам добавляли белок DARPin-mCherry до конечной концентрации 1 мкМ, инкубировали при 4° в течение 30 мин, клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером и визуализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710-NL0 («Carl Zeiss», Германия) при следующих параметрах: возбуждение лазером 561 нм, регистрация флуоресценции в диапазоне 570—735 нм.
Проточная цитофлуориметрия. Для количественной оценки связывания белка DARPin-mCherry в популяции клеточных линий SKBR-3 (HER2/ /neu-гиперэкспрессирующих) и CHO (HER2/neu-отрицательных) клетки инкубировали во флаконах и снимали с подложки раствором Версена (без использования трипсина). Клетки инкубировали с 1 мкМ раствором DARPin-mCherry в течение 15 мин при 4°, дважды отмывали холодным PBS и проводили измерения на приборе FACS Scan Calibur («Becton-Dickinson», США). Данные анализировали с помощью программы WinMDI 2.8 (Scripps Research Institute).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Целью настоящей работы явилось создание в качестве альтернативы флуоресцентно меченым антителам химически и оптически стабильного препарата рекомбинантного флуоресцентного белка, который будет легко продуцироваться в гетерологичной системе экспрессии, специфически и с высокой аффинностью связываться с мишенью и иметь высокое соотношение сигнал/шум при детекции. Для этого мы использовали сочетание двух белков: белка не-иммуноглобулиновой природы DARPin9-29, специфически связывающегося с опухолевым маркером HER2/neu, в качестве нацеливающего модуля [7] и красного флуоресцентного белка mCherry в качестве в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.