ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 7, с. 802-813
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.224.2
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ РАЗЛИЧИЕ ПОЧТИ ИЗОГЕННЫХ ЛИНИЙ Triticum aestivum L. ПО ФОТОПЕРИОДИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
© 2014 г. А. А. Киселева1, Э. Э. Егги1, В. А. Кошкин1, М. Н. Ситников4, М. Родер3, Е. А. Салина2, Е. К. Потокина1
всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова, Санкт-Петербург 190000
e-mail: e.potokina@vir.nw.ru 2Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090 3Институт генетики культурных растений, Гатерслебен, Германия 4Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова, кафедра общей генетики, селекции и семеноводства, Нальчик 360000 Поступила в редакцию 30.10.2013 г.
На материале почти изогенных линий мягкой гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum L. проведена идентификация генетических детерминант, определяющих различную степень чувствительности линий к фотопериоду, с использованием SSR-маркеров и маркеров, специфичных к генам Vrn и Ppd. Установлено, что линия Ppd-s содержит доминантный аллель Ppd-D1a, расположенный на 2Б-хро-мосоме. Данный аллель характеризуется обширной делецией в промоторной области гена. Для двух других линий, Ppd-m и Ppd-w, показана интрогрессия гена Ppd-B1 на 2В-хромосоме от слабочувствительного к длине дня родительского сорта Sonora, но описанный ранее аллель Ppd-B1a.1 не обнаружен. Для этих линий выявлен другой полиморфизм, который может быть причиной слабой фотопериодической чувствительности — увеличенное число копий гена Ppd-B1.
DOI: 10.7868/S0016675814050075
Мягкая гексаплоидная пшеница (Triticum aestivum L.) — важная сельскохозяйственная культура, приспособленная к возделыванию в различных экологических условиях. Длительная доместикация пшеницы позволила приспособить данную культуру к широкому спектру климатических условий. Во многом это стало возможно благодаря варьированию такого важного адаптивного признака, как время цветения вне зависимости от внешних факторов.
На переход от вегетативной к генеративной фазе развития у пшеницы влияют три основные группы генов: гены VRN (vernalisation response), определяющие потребность в яровизации или ее отсутствии; гены Ppd (photoperiod response), определяющие реакцию растения на удлинившийся световой день; а также локус Eps (earliness per se), детерминирующий раннее цветение [1].
Гены Ppd, отвечающие за чувствительность растения к длине дня (фотопериоду), играют важную роль при адаптации сортов пшеницы к разным агроклиматическим условиям. Впечатляющие результаты "зеленой революции" 60-х г. XX в. были достигнуты, в том числе, благодаря переносу в создаваемые сорта новых аллелей генов нейтральности к световому периоду (Ppd), что позво-
лило значительно расширить ареал возделывания пшеницы [2].
Мягкая пшеница — длиннодневное растение с ярко выраженной реакцией на продолжительность светового дня (сильная фотопериодическая чувствительность). Это означает, что при выращивании растений в условиях короткого дня (10 ч и меньше) наблюдается значительная задержка в сроках цветения по сравнению со сроками, наблюдаемыми у тех же генотипов в условиях длинного фотопериода (14 ч и более), при условии, что потребности растений в яровизации полностью удовлетворены [3]. Современные сорта пшеницы варьируют по своей фотопериодической чувствительности (ФПЧ) от сильночувствительных до абсолютно нечувствительных, способных к колошению даже в условиях короткого 8-часового дня [4]. Как правило, сорта, обладающие слабой фотопериодической чувствительностью, скороспелые. Слабая ФПЧ считается важным свойством современных высокоадаптивных сортов со стабильно высокой продуктивностью [5].
Сорта со слабой ФПЧ, зацветающие без задержки в условиях короткого дня, появились в результате отбора растений, несущих мутации в генах Ppd-1, расположенных на хромосомах второй го-меологичной группы: 2А, 2В и 2Э [3]. В соответ-
ствии с рекомендациями новой номенклатуры [6] эти гены обозначаются как Ppd-A1 (хромосома 2A), Ppd-B1 (хромосома 2B), Ppd-D1 (хромосома 2D). Полная нуклеотидная последовательность определена для всех трех генов у мягкой пшеницы [3]. Ввиду очевидной важности признака ФПЧ для селекции высокоадаптивных сортов пшеницы естественное аллельное разнообразие генов Ppd, представленное в генофонде T. aestivum, является объектом интенсивных исследований.
С 1994 по 2004 г. во ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР) в целях локализации генов Ppd на хромосомах, а также для оценки их прямых и плейотропных эффектов была создана серия почти изогенных линий мягкой пшеницы (Near Isogenic Lines, NILs), контрастных по ФПЧ [7, 8]. По результатам полевых испытаний линий на коротком и длинном дне было сделано предположение, что каждая пара созданных линий отличается присутствием доминантного аллеля только одного из генов Ppd (Ppd-A1, Ppd-B1 или Ppd-D1).
Цель исследования — идентификация генетических локусов, детерминирующих различную степень чувствительности к фотопериоду серии почти изогенных линий T. aestivum, с помощью методов молекулярного маркирования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исходным материалом для создания почти изогенных линий послужили три контрастных по ФПЧ родительских генотипа яровой мягкой пшеницы (сорт Фотон (К-55696), сорт Sonora (К-47942) и линия ФЧЛ 2 (К-142751)) [7]. В качестве реципиента использовалась чувствительная к длине дня линия ФЧЛ 2. Донорами доминантных аллелей генов Ppd были сорта со слабой ФПЧ — Фотон и Sonora.
Родительский генотип Sonora (К-47942) поступил из Мексики в коллекцию ВИР под названием Sonora 64 (под таким же наименованием он упоминается в предыдущих публикациях по изо-генным линиям [5, 7]). Однако при последующем генетическом анализе было установлено, что данный образец пшеницы К-47942, на самом деле не идентичен хорошо известному в литературе сорту Sonora 64 [3, 5]. Во избежание путаницы родительский генотип, описанный в данном исследовании, именуется как Sonora.
SSR-анализ. Для проведения молекулярно-ге-нетического анализа геномную ДНК выделяли из свежих листьев растений родительских генотипов и почти изогенных линий CTAB-методом [9].
При генотипировании линий были проанализированы микросателлитные локусы, опубликованные ранее [10, 11]. Использованный при анализе состав реакционной смеси и режим ПЦР полностью соответствовали рекомендациям ори-
гинальных публикаций. Визуализацию и анализ амплифицированных фрагментов частично проводили с использованием секвенатора ALF (Automated Laser Fluorescence, Amersham, Великобритания) на базе лаборатории геномного картирования Института генетики культурных растений (Германия), частично с использованием автоматической станции капиллярного электрофореза высокого разрешения QIAxcel System Capillary Electrophoresis (Qiagen, Германия) в ВИР. Размер фрагментов в первом случае определяли с использованием компьютерной программы Fragment Analyzer 1.02 (Pharmacia, Швеция). При использовании QIAxcel длину фрагментов рассчитывали с помощью внутренних стандартов, в качестве которых были использованы маркеры соответствия (QX Alignment Marker 15bp/500bp), устанавливающие верхний (500 пн) и нижний (15 пн) пороги детекции. Одновременно использовался внутренний стандарт — набор фрагментов ДНК известного размера (QX Size Marker 25bp/500bp), различающихся по длине на 25 нук-леотидов.
Изучение возможного полиморфизма генов Vrn. Для выявления возможного полиморфизма генов Vrn-A1, Vrn-B1 и Vrn-D1 были использованы опубликованные ранее геноспецифичные маркеры [12—14], анализ проводился по методикам, подробно описанным нами ранее [15, 16].
Анализ полиморфизма генов Ppd с использованием опубликованных аллель-специфичных праймеров. Для выявления аллелей генов семейства Ppd, которые могут детерминировать слабую ФПЧ, были использованы опубликованные ранее геноспеци-фичные праймеры [3, 17, 18] (таблица). Состав реакционной смеси был следующим: ДНК в концентрации 5 нг/мкл, 1х буфер для Taq-полимера-зы (pH 8.6, 2.5 мМ Mg2+), 200-250 мкмоль dNTPs, по 0.2-0.25 мкмоль каждого из праймеров, 0.10.125 ед./мкл Taq-полимеразы (Dialat) и стерильная деионизированная вода до объема 20-25 мкл в зависимости от реакции. Условия проведения ПЦР для выявления аллелей генов Ppd (за исключением аллеля Ppd-B1a.1): преденатурация при 94-96°С в течение 3 мин и далее 35-40 циклов (94-96°С в течение 20-30 с; 52-57°С в зависимости от структуры праймера в течение 20-30 с; 72°С в течение 40-60 с) и финальная элонгация при 72°С в течение 5 мин. Для выявления аллеля Ppd-B1a.1 использовали протокол "touch-down" ПЦР: преденатурация при 96°С в течение 3 мин, далее 11 циклов (96°С в течение 30 с; 70°С в течение 30 с с понижением температуры на 1°С в каждом последующем цикле; 72°С в течение 30 с), 29 циклов (96°С в течение 30 с; 60°С в течение 30 с; 72°С в течение 60 с) и финальная элонгация при 72°С в течение 5 мин. Более подробно данные методики описаны ранее [3, 17, 18].
Последовательности праймеров, использованные для выявления доминантных аллелей генов семейства Ppd, детерминирующих слабую фотопериодическую чувствительность
Аллель Название праймера Последовательность Длина фрагмента, пн Источник
Ppd-D1a.1 Ppd1_F ACGCCTCCCACTACACTG 288 (414*) [3]
Ppd1_R2 CACTGGTGGTAGCTGAGATT
Ppd1_R1 GTTGGTTCAAACAGAGAGC
Ppd-A1a.2 durum_Ag5del_F1 GTATGCGATTCGCCTGAAGT 173 (245*) [17]
durum_Ag5del_F2 CGTCACCCATGCACTCTGTT
durum_Ag5del_R1 GAGCAAGGGATTGAGACTGC
Ppd-A1a.3 durum_Ag5del_F1 GTATGCGATTCGCCTGAAGT 290 (452*) [17]
durum_Ag5del_F2 CGTCACCCATGCACTCTGTT
durum_Ag5del_R2 CTGGCTCCAAGAGGAAACAC
Ppd-A1a.1 TaPpd-AlprodelF CGTACTCCCTCCGTTTCTTT 338 (299*) [18]
TaPpd-A1prodelR3 AATTTACGGGGACCAAATACC
TaPpd-A1prodelR2 GTTGGGGTCGTTTGGTGGTG
Ppd-B1a.1 TaPpd-B1proF1 CAGCTCCTCCGTTTGCTTCC 620 (312*) [18]
TaPpd-B1int1R1 CAGAGGAGTAGTCCGCGTGT
* Размер продукта в случае интактного (рецессивного) аллеля.
ПЦР в реальном времени. ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили с помощью системы Bio-RadiCycler iQ (США) с использованием коммерческого
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.