ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 7, с. 862-867
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 577.21:599.735.5
ВЫЯВЛЕНИЕ ГИБРИДОВ ЕВРОПЕЙСКОЙ (Capreolus capreolus L.) И СИБИРСКОЙ (C. pygargus Pall.) КОСУЛЬ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА
© 2014 г. Д. А. Плахина, Е. Ю. Звычайная, М. В. Холодова, А. А. Данилкин
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, Москва 119071
e-mail: dplahina@mail.ru Поступила в редакцию 16.12.2013 г.
С целью выявления гибридных особей европейской (Capreolus capreolus) и сибирской (C. pygargus) косуль проведен анализ 130 образцов их тканей из девяти областей России и с территории Украины с помощью анализа микросателлитных локусов. Для определения видовой принадлежности животных и поиска межвидовых гибридов подобран оптимальный комплекс из 21 микросателлитного ло-куса. В Московской и Волгоградской областях выявлены гибридные особи, доля которых в суммарной выборке из европейской части России составляет 11.9%.
DOI: 10.7868/S0016675814070157
В настоящее время Восточную Европу населяет и европейская (Саргво1ш еаргвоШз), и сибирская (С. pygargus) косули. "Зона гибридизации", образовавшаяся в результате естественного и искусственного расселения животных, весьма обширна и простирается от правобережья Волги до Восточной Польши [1—3, Ма1о8шк М., Borkowska А., 8'т81оека М., неопубл. данные]. В Подмосковье, например, 22% особей несут мтДНК европейской косули, 78% — сибирской [4]. В связи с имеющей место межвидовой гибридизацией зоологи, систематики, специалисты охотничьего хозяйства и охотники постоянно сталкиваются с проблемой
идентификации видовой принадлежности особей [5] и их трофеев. Не исключено, что большая часть рекордных трофеев европейской косули, добытых в Восточной Европе (табл. 1), в действительности принадлежит сибирской косуле или, возможно, гибридным особям.
Полевое определение европейской и сибирской косуль возможно по ряду морфологических признаков [7, 8], но во многих случаях, особенно в трофейном деле, они малопригодны. В последние два десятилетия точная идентификация видовой принадлежности косуль проводится молеку-лярно-генетическими методами [3, 5, 6, 9—12].
Таблица 1. Рекордные параметры трофеев европейской и сибирской косуль, добытых на территории России в конце ХХ—начале XXI вв.*
Место добычи, область Длина рогов, см Размах, см Окружность (розетки) рогов, см Количество отростков
Европейская косуля
Московская** »** Московская Белгородская 31.8/28.9 24.8/27.3 25.1/25.7 25.1/26.4 27.6 22.9 16.2 11.7 12.4/12.7 11.4/11.4 9.5/10.2 12.4/13.3 3/3 3/3 3/3 3/3
Сибирская косуля
Курганская » » » » ? 40.3/42.2 34.3/35.2 37.5/35.2 32.4/31.1 34.9/36.5 32.7/32.1 47.3 39.1 35.6 26.0 27.3 31.8 18.4/18.1 17.1/17.8 13.3/13.0 21.9/21.9 16.8/17.1 16.5/18.1 3/3 3/3 3/3 5/5 5/3 6/7
* По: [6].
** Вероятные трофеи сибирской косули или гибридных особей.
Таблица 2. Локализация и видовая принадлежность образцов
Номера образцов в коллекции ИПЭЭ РАН Места сбора образцов Видовая принадлежность
594-596, 600, 785-792, 798 Западная, Юго-Западная Украина (п = 13) С. саргвоЫь
601, 602, 606-608, 612 Брянская область (п = 6) С. саргеоЫь
849, 851, 854-863 Сочинский нац. парк (п = 12) С. capreolus
1158-1161, 1165-1168 Республика Якутия (п = 7) С. pygargus
1379, 1461, 1462, 1464, 1471-1475, 2798, 1483-1485, 1487-1495, 1497-1506, 1517-1521 Московская область (п = 33) С. саргео1и$, 1494, 1517, 2798 - гибриды* (Ступинский, Наро-Фоминский районы)
1507-1510, 1512, 1513 Алтайский край (п = 6) С. pygargus
1909-1914 Ставропольский край (п = 6) С. pygargus
2506, 2507, 2509, 2511-2515, 2517, 2520-2526, 2757-2760, 2762-2770, 2772, 2773 Самарская область (п = 31) С. pygargus
2776-2780 Саратовская область (п = 5) С. pygargus
3483-3487, 3508-3512 Украина, Днепропетровская область, Самарский лес (п = 8) С. pygargus
2782-2784 Волгоградская область (п = 3) С. capreolus, 2783, 2784 — гибриды* (Даниловский район)
* Гибриды выделены по результатам исследования.
Основная цель нашей работы — подобрать оптимальный комплекс микросателлитных локусов для определения видовой принадлежности косуль и поиска межвидовых гибридов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования использованы заспиртованные образцы тканей 130 особей европейской и сибирской косуль из девяти областей России и с территории Украины (табл. 2), где наиболее вероятна гибридизация. Всего в анализ включено 26 микросателлитных локусов.
ДНК выделена с использованием наборов "Diatom DNA Prep 200" (Изоген, Москва) и "Invitek" (STRATEC Molecular, Германия) с помощью автоматической системы Kingfisher Flex Thermo Scientific (Fisher Scientific, Малайзия). Амплификацию проводили в 10 мкл с использованием 2 мкл набора для полимеразной цепной реакции (ПЦР) X5MasterMix (Диалат, Москва) с добавлением по-лимеразы SmartTAQ (Диалат) по 0.1 мкл на 1 пробу, 1 мкл полученного раствора ДНК, по 1 мкл прямого и обратного праймера (5 пмоль/мкл). Для амплификации использовали микросател-литные праймеры для анализа копытных: RT20, RT23, RT30, Roe01, Roe09, CSSM41, IDVGA8, BM757, BM203, BMC1009, BM4107, BM6438 [13— 15, 19]. Реакцию проводили при следующем режиме: 95°С — 2 мин 15 с; 60°С — 15 с (для прайме-ров BM6438 и BM203 — 57°С); 72°С — 1 мин ; 60°С —
15 с (30 циклов) (для праймеров BM6438 и BM203 -57°С и 35 циклов); 72°С - 5 мин (1 цикл); 15°С -3 мин 30 с. Кроме того, ставили три мультилокус-ных ПЦР (1-й мультиплекс: OheQ, B142, NVHRT16, BMC745; 2-й RT24, BM6506, NVHRT30, BMS1788, RT6; 3-й RT1, RT5, BM4513, RT27, RT9short) [13-20] со следующим составом смеси: по 0.5 мкл/пробу хлорида магния, 1 мкл/пробу буфера, 1 мкл/пробу dNTP, по 2 мкл/пробу смеси праймеров и по 1 мкл/пробу полученного раствора ДНК. Реакцию проводили при следующем режиме: 95°С - 15 мин (1 цикл); 94°С - 30 с; 57°С - 1 мин; 72°С - 1 мин 20 с (35 циклов); 60°С - 30 мин (1 цикл). ПЦР осуществляли с помощью амплификатора "Tetrad2" (Bio-Rad, США). Электрофорез и фрагментный анализ продукта амплификации выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) с использованием размерного стандарта LIZ500. Результаты фрагмент-ного анализа считывали с помощью программы GeneMapper (Applied Biosystems, США) и обрабатывали, в том числе рассчитывали показатели генетического разнообразия, с помощью приложений MS-tools [21] и GenAlEx 6.4 [22] для Microsoft office Excel, а также программы "Structure 2.3.4" [23].
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам исследования праймеры RT20, RT23, CSSM41 были исключены из эксперимента, так как при их использовании наблюдались
864 ПЛАХИНА и др.
Таблица 3. Показатели генетического разнообразия двух видов косуль
Виды Показатели Na Ne Ho He F
C. capreolus Среднее 11.471 4.987 0.371 0.694 0.479
SE 1.541 0.805 0.055 0.054 0.057
C. pygargus Среднее 9.529 4.515 0.448 0.691 0.376
SE 1.099 0.602 0.059 0.052 0.062
Для обоих видов Среднее 10.500 4.751 0.409 0.692 0.428
0.496
SE 0.947 0.040 0.037 0.043
Примечание. 8Е — стандартная ошибка, Ыа — число аллелей на локус, N — эффективное число аллелей на локус, Н0 — наблюдаемая гетерозиготность, Не — ожидаемая гетерозиготность, Ж — коэффициент инбридинга.
эффекты неспецифичной амплификации или отсутствия амплификата. Стабильно воспроизводимый результат получен для 22 локусов: Roe01, Roe09, RT30, ГО\ОА8, ВМ203, ВМС1009, ВМ4107, ВМ8438, OheQ, В142, NVHRT16, ВМС745, RT24, ВМ6506, NVHRT30, ВМ81788, RT6, RT1, RT5, ВМ4513, RT27 и RT9short.
В результате фрагментного анализа 130 образцов косуль выявлено, что локус ВМС745 представлен одним аллелем, изменчивость остальных локусов была выше (от 4 до 23 аллелей на локус). Вследствие мономорфности локус ВМС745 удален из анализа. Таким образом, 21 локус признан перспективным для работы. Для 17 пар прайме-ров ^Т1, RT5, ВМ4513, RT27, RT9short, ВМ6506, NVHRT30, ВМ81788, RT6, OheQ, BL42, NVHRT16, ВМС745, Roe09, Roe01, RT24, IDVGA8) получены полноценные данные: во всей выборке найден 231 аллель, из которых для европейской косули видоспецифичны 66 аллелей (т.е. у сибирской они не встречаются), для сибирской — 26. Процент полиморфных локусов для обоих видов равен 94.12%. Аллельное разнообразие и эффективное число аллелей на локус у европейской косули превышают таковые оценки для сибирской косули (табл. 3). Коэффициент инбридинга также вы-
ше у европейской косули (F = 0.479 ± 0.057): c долей гомозиготных локусов — 47.9%, а у сибирской косули — 37.6%.
Заметим, что при обработке большого количества образцов следы общих аллелей могут стираться из-за специфики математической модели. Поэтому для более точного анализа выборка была поделена на несколько частей по географической приуроченности, а затем разные комбинации этих частей были проанализированы в программе "Structure 2.3.4".
Образцы, исследованные при помощи этой программы, распределяются на две группы в соответствии с видовой принадлежностью (рис. 1—4), т.е. используемый анализ 21 микросателлитного локуса позволяет четко различить два вида косуль. Этот комплекс праймеров позволяет также выявить животных, имеющих общие для обоих видов аллели, и гибридных особей. Например, на рис. 1 особи под номерами 13 (1490), 35 (1161), 37(1166) несут отдельные общие для обоих видов аллели, и вероятность их попадания в один из двух кластеров не 100%, а немного меньше. Образцы 17 (1494), 29 (1517) и 33 (2798) из Московской области можно уверенно отнести к гибридам, так как вероятности попадания в один или
1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 -0 -
1 3 5 7 9 11 13 15 1 7 19 21 23 25 27 29 31 33 35 3 7 39 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
I I I I I I I I I I I I П^ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
Рис. 1. Видовая дифференциация и выявление гибридных особей в группах образцов тканей косуль из Московской области (1—33, C. capreolus) и Якутии (34—39, C. pygargus). Гистограмма построена с помощью программы "Structure 2.3.4". По оси абсцисс даны порядковые номера образцов, по оси ординат — вероятность попадания в один из двух кластеров (к = 2, Admixture Model и Allele Frequencies are Independent),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.