МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 3, с. 370-371
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 579.68
ВЫЯВЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИН-ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ВОДОЕМАХ ВЕРХНЕЙ ВОЛГИ
© 2013 г. С. И. Сиделев*, 1, А. А. Фомичев**, О. В. Бабаназарова*, А. А. Зубишина*
*Ярославский государственный университет имени П.Г. Демидова **ГУЗЯО "Ярославское областное бюро судебно-медицинской экспертизы" Поступила в редакцию 20.05.2012 г.
БО1: 10.7868/80026365613020146
Микроцистины — это гепатотоксичные циклические пептиды, синтез которых осуществляется нерибосомно мультиферментным комплексом, включающим пептидсинтетазу (NRPS), поликети-дсинтазу (PKS) и ряд других ферментов [1, 2]. Способность к продуцированию микроцистинов установлена у планктонных цианобактерий из родов Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Anabaenopsis, Os-cillatoria, Phormidium и Nostoc [2]. Кластер генов, кодирующий ферменты, ответственные за синтез микроцистинов (mcy) имеет модульную структуру [1]. В настоящее время известно более 90 структурных вариантов микроцистинов, среди которых в большей степени распространены микроцистины LR, RR и YR, а наиболее токсичен микроци-стин-LR [2]. В связи с этим, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) установила ПДК для микроцистина-LR в питьевых водах — 1 мкг/л [2].
В России систематические исследования циа-нотоксинов с использованием современных методов были начаты несколько лет назад [2—4]. Во время массового развития цианобактерий в водоемах могут присутствовать морфологически неразличимые как токсичные, так и нетоксичные штаммы одного вида. Молекулярно-биологиче-ский подход может являться довольно эффектив-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: Sidelev@mail.ru).
ным инструментом в обнаружении токсигенных цианобактерий. Однако на данный момент в России подобные исследования проведены лишь для Прибайкальского региона [3]. Цель данной работы — обнаружение микроцистин-продуцирую-щих цианобактерий в водоемах Верхней Волги.
Пробы воды из озера Неро, реки Волга в районе г. Ярославль и в устье правого ее притока — реки Солоница были отобраны в июле и сентябре 2009—2011 гг. (таблица). Определение биомассы цианобактерий проводилось в камере Нажотта счетно-объемным методом. Концентрации мик-роцистина-LR определяли с помощью иммуно-ферментного анализа (ИФА), используя набор реагентов ELISA Kit ("Abraxis LLS") согласно методике фирмы-производителя. В 2009 г. в пробе фитопланктона из реки Солоница было установлено содержание внутриклеточного микроцисти-на-LR, позднее, в остальных пробах определялся растворенный в воде микроцистин-LR. Выделение ДНК из образцов осуществляли стандартным набором реагентов Diatom DNA Prep 200 (OOO "Лаборатория Изоген"). Амплификацию специфического участка гена синтеза микроцистинов mcyE проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием HEP-праймеров в соответствии с условиями, описанными в работе [1]. В качестве положительного
Результаты ПЦР-анализа, концентрации микроцистина-LR (MC-LR) и количественные показатели обилия цианобактерий в водоемах Верхней Волги
Дата отбора пробы Водоем Биомасса в пробе, мг/л Наличие гена mcyE MC-LR, мкг/л
Cyanobacteria Microcystis Anabaena Planktothrix
03.09.2009 р. Солоница 7704.0 6954.0 307.0 - + >5.0
14.07.2010 оз. Неро 18.0 0.8 2.6 2.9 + >5.0
09.07.2011 оз. Неро 136.9 93.7 34.0 - + >5.0
25.07.2011 р. Волга 1481.8 158.8 0.9 - + 0.5
ВЫЯВЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИН-ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЦИАНОБАКТЕРИИ
371
M 1 2 3 4 K- M
— 400
— 500
Электрофореграмма амплифицированных с НЕР-праймерами фрагментов ДНК фитопланктона водоемов Верхней Волги. Дорожки: 1 — р. Солоница (положительный контроль), 2 — оз. Неро 9.07.2011, 3 — р. Волга, 4 — оз. Неро 14.07.2010, К (—) — отрицательный контроль (Gloeocapsa decorticans), М — маркер молекулярного веса (п.н.).
thrix. Потенциально токсигенными цианобакте-риями являлись виды родов Microcystis (M. aeruginosa, M. wesenbergii, M. viridis, M. flos-aquae, M. no-vacekii), Anabaena (A. spiroides, A. affinis, A. flos-aquae) и Planktothrix agardhii (таблица). Как в положительном контроле, так и во всех остальных пробах был обнаружен ПЦР-продукт ожидаемой длины (около 470 п.н.), что свидетельствует о присутствии гена синтеза микроцистинов у ци-анобактерий в исследованных водоемах (рисунок). Результаты молекулярно-генетического анализа были подтверждены прямым определением мик-роцистина-LR в воде озера Неро и реки Волга с помощью ИФА (таблица). Концентрация данного гепатотоксина в большинстве проб превышала верхний порог чувствительности метода и ПДК, установленную ВОЗ, по крайней мере, более чем в 5 раз (таблица).
Таким образом, впервые для водоемов Верхней Волги молекулярно-генетическим и иммунофер-ментным анализами было определено наличие популяций цианобактерий, синтезирующих гепа-тотоксин микроцистин.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-31280 и проекта 4.4532.2011 Минобрнауки РФ.
контроля использовали суммарную ДНК цианобактерий реки Солоница, в клетках которых ранее был обнаружен микроцистин-LR. В отрицательной контрольной реакции использовали ДНК не продуцирующей микроцистинов ци-анобактерии (альгологически чистая культура вида Gloeocapsa decorticans, предоставлена кафедрой ботаники и микробиологии ЯрГУ им. П.Г. Демидова). Продукты ПЦР фракционировали электро-форетически в 2% агарозном геле и анализировали в УФ-свете после окрашивания бромистым этиди-ем. Размер амплифицированных фрагментов ДНК определяли с использованием внешних стандартов молекулярных масс.
Впервые для Волжского бассейна был проведен поиск токсигенных цианобактерий, содержащих ген микроцистинсинтетаз mcyE. В отобранных пробах фитопланктона доминировали ци-анобактерии из родов Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Gloeotrichia, Aphanizomenon и Limno-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Jungblut A.-D., Neilan B.A. Molecular identification and evolution of the cyclic peptide hepatotoxins, mi-crocystin and nodularin, synthetase genes in three orders of cyanobacteria // Arch. Microbiol. 2006. V. 185. P. 107-114.
2. Волошко Л.Н., Плющ А.В., Титова Н.Н. Токсины цианобактерий (Cyanobacteria, Cyanophyta) // Альгология. 2008. Т. 18. № 1. С. 3-20.
3. Тихонова И.В., Белых О.И., Помазкина Г.В., Гладких А.С. Анализ цианобактерий озера Байкал и Усть-Илимского водохранилища на наличие гена синтеза микроцистина // Доклады АН. 2006. T. 409. C. 425427. [Tikhonova I.V., Byelykh O.I., Pomazkina G.V., Gladkikh A.S. Analysis of cyanobacteria from Lake Baikal and the Ust-Ilim Reservoir for the gene responsible for mycrocystin synthesis // Doklady Biol. Sci. 2006. V 409. P. 320-322.]
4. Babanazarova O.V., Kurmayer R., Sidelev S.I., Aleksand-rina E.M., Sakharova E.G. Phytoplankton structure and microcystin concentration in the highly eutrophic Nero lake // Water Res. 2011. V 38. № 2. P. 229-236.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 82 № 3 2013 8*
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.