ш
УДК 582.282.123.4:577.152.34
ВЫЯВЛЕНИЕ МИШЕНИЙ ДЕЙСТВИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕАЗ - АКТИВАТОРОВ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА, ОБРАЗУЕМЫХ МИКРОМИЦЕТАМИ Aspergillus ochraceus
И Aspergillus terreus1
© 2015 г. Е. С. Звонарева*, А. А. Осмоловский*, #, В. Г. Крейер*, Н. А. Баранова*,
И. Б. Котова*, Н. С. Егоров**
*Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,
119234, Москва **Международный биотехнологический центр Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, 119234, Москва Поступила в редакцию 31.03.2015 г. Принята к печати 07.05.2015 г.
Выявлены различия воздействия внеклеточных протеаз Aspergillus ochraceus и A. terreus на белки плазменного гемостаза, заключающегося в инициации активации белков протромбинового комплекса. Обнаружено, что протеазы, образуемые A. ochraceus оказывают прямое воздействие на проферменты протеин С и фактор свертывания Х, а экзопротеаза A. terreus вызывает их активацию опосредованно, через стимуляцию системы калликреина. На примере A. terreus впервые показана способность внеклеточных протеаз микромицетов активировать прекаллекреин плазмы крови человека.
Ключевые слова: внеклеточные протеазы микромицетов, протеазы-активаторы белков системы гемостаза.
DOI: 10.7868/S0132342315050152
ВВЕДЕНИЕ
Процессы, протекающие в кровеносном русле и обеспечивающие поддержание жидкого состояния крови, предупреждение и остановку кровотечений, составляют систему гемостаза. Одним из компонентов этой системы является плазменный (коа-гуляционный) гемостаз, представляющий собой каскад реакций ограниченного протеолиза факторов свертывания крови и завершающийся образованием фибрина [1]. Протеазы гемостаза, как правило, активны в отношении своих субстратов — предшественников других протеаз в этом каскаде и обладают довольно узкой субстратной специфичностью. Это свойство послужило основой для разработки лабораторных методов диагностики содержания ряда белков плазменного гемостаза, необходимых для выявления патологического состояния пациентов. Некоторые из таких методов — например
1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г.
Сокращения: КФС — контактная фаза свертывания, ПТК — протромбиновый комплекс, ФКФС — факторы контактной фазы свертывания, Glp — пироглутаминовая кислота, pNA — п-нитроанилид.
#Автор для переписки (тел.: +7 (495) 939-30-33, e-mail: aosmol@mail.ru).
методы определения плазминогена, протеина С, прекалликреина, протромбина, фактора Х, — основаны на расщеплении ими чувствительных хромо-генных пептидных субстратов после предварительной инкубации в присутствии белков-активаторов. В качестве активаторов применяют специальные протеазы, получаемые из яда змей [2].
С использованием этого подхода было показано, что внеклеточные протеазы микромицетов рода Aspergillus также способны расщеплять специфичные для белков системы гемостаза хромоген-ные пептидные субстраты и активировать ряд проферментов плазменного гемостаза (протеин С, фактор Х и протромбин) [3]. Такие протеазы могут оказаться перспективными заменителями недешевых белков-активаторов в соответствующих диа-гностикумах. На это, в частности, указывает простота их получения, а также некоторые свойства. Так, например, было показано, что A. ochraceus образует протеазы — активаторы протеина С, по свойствам схожие с протеазами-активаторами, получаемыми из яда южно-американского щитомордника и используемыми для диагностики протеина С [4—6]. Хорошо известно, что протеазы аспергиллов и микромицетов некоторых других родов, выступая в качестве факторов патогенно-
559
4*
Я
л
Я
л
10
20 30 40 Номер пробы (б) 2
50
1.4 - 1.0
1.2 0.8
1.0
0.8 о" ОС 28 0.6
0.6< _ 0.4
0.4
0.2 " 0.2
0 - 0 0
1.4 - 1.0
1.2 _ 0.8
1.0
0.8 о" 8 0.6
2 0.6< _ 0.4
0.4
0.2 " 0.2
10 20 30 40 50 Номер фракции
60
Рис. 1. Изоэлектрофокусирование комплексного препарата внеклеточных протеаз А. оекгаееш L-1 (а) и А. terreus 2 (б) после глубинного культивирования (1) рН, (2) белок, (3) активаторная к протеину С активность. Диапазон рН амфолинов 5.0—7.0 (а) и 2.5—5.0 (б).
сти, способны свертывать плазму крови [7]. Однако механизмы и мишени их воздействия до конца остаются невыясненными, что может затруднять интерпретацию результатов при диагностическом использовании протеаз микромицетов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Микромицеты А. оекгаееш Ь-1 и А. terreus 2 были отобраны в результате предыдущих исследований в качестве перспективных продуцентов внеклеточных протеаз — активаторов протеина С и фактора Х [3]. Протеолитические ферменты, выделенные из культуральной жидкости этих микро-мицетов, различались изоэлектрическими точками и проявлением активаторных к протеину С и фактору Х свойств при инкубации с плазмой, дефицитной по белкам протромбинового комплекса (ПТК) — протромбину, факторам VII, IX, X и протеинам С, S, Z, — а именно: протеазы А. terreus 2 практически полностью сохраняли указанные актива-торные активности, в отличие от протеаз А. оекга-еeus Ь-1 [3].
Различия в действия протеаз А. oекraеeus Ь-1 и А. terreus 2 на белки системы гемостаза могут быть обусловлены их воздействием на разные мишени. Протеазы А. oекraеeus Ь-1 могут активировать как протеин С, так и фактор Х, а протеазы А. terreus 2 — один из белков, не входящих в ПТК, что следует из полученных ранее данных [3]. Вероятно, наиболее подходящим проферментом-мишенью протеазы А. terreus 2 в плазме может служить пре-калликреин. Для проверки этого предположения определяли активаторную к прекалликреину активность в культуральной жидкости микромице-та с помощью хромогенного пептидного субстрата калликреина Н-.0-Рго-РИе-Агн-рМА ^-2302), после предварительной инкубации с плазмой. Результаты реакции показали, что протеазы, образуемые А. terreus 2, могут активировать прекалли-креин в соответствии со схемой:
Протеаза А. terreus 2 + прекалликреин плазмы —
—»- калликреин
Калликреин + Н-^-Рго-РИе-Аг§-рМА—
— Н-Я-Рго-РИе-А^-ОН + Н-рМА
При определении активности в культуральной жидкости А. oекraеeus Ь-1 наблюдали, что проте-азы этого микромицета также способны вызывать расщепление субстрата калликреина после пре-динкубации с плазмой.
Выявление мишени действия протеаз, образуемых А. terreus 2, проводили в сравнении с внеклеточными протеазами А. oекraеeus Ь-1 после получения препаратов белков культуральной жидкости и их последующего разделения методом изоэлектро-фокусирования под контролем активаторной к протеину С активности. В результате были получены фракции с р/5.6 и 6.7 для протеаз А. oекraеeus Ь-1 и 4.4 и 4.7 для протеаз А. terreus 2 (рис. 1а, 1б). Гомогенность выделенных белков была подтверждена электрофоретическим анализом.
Сравнение активаторных к протеину С, фактору Х и прекалликреину активностей выделенных протеаз представлено в табл. 1. Как видно из таблицы, указанными активностями обладают все четыре протеазы, проявляя близкие значения активностей. Наибольшими удельными активатор-ными активностями к протеину С (с субстратом С1р-Рго-Аг§-рМА, S-2366), к фактору Х (с субстратом Z-.D-Aгg-G1y-Aгg-pNA, S-2765) и прекалликреину (с субстратом S-2302) обладал микромицет А. terreus2, значения которых составили 77.1, 43.4 и 145.6 х 10-3 ед. акт./А280 соответственно. Активаторная к прекалликреину активность была в целом выше остальных активностей у изученных протеаз. Белки этих фракций сходны по субстратной специфичности и, по-видимому, могут являться изо-формами одной протеазы.
0
0
0
0
ВЫЯВЛЕНИЕ МИШЕНИЙ ДЕЙСТВИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕАЗ 561
Таблица 1. Активаторная к протеину С, Х фактору и прекалликреину активность протеаз A. ochraceus L-1 и A. terreus 2 во фракциях после изоэлектрофокусирования
Активаторная активность с субстратами Активность х10 3, ед. акт./А280
A. ochraceus L-1 A. terreus 2
pI 5.6 pI 6.7 pI 4.4 pI 4.7
Glp-Pro-Arg-pNA 23.7 61.2 62.5 77.1
Z-^-Arg-Gly-Arg-pNA 20.4 34.5 34.7 43.4
H-D-Pro-Phe-Arg-pNA 73.4 98.6 145.6 91.3
Расщепление определенного хромогенного субстрата может быть вызвано как способностью микромицетов активировать конкретные проферменты гемостаза, так и их воздействием на один и тот же профермент, запускающий при активации цепочку реакций, приведшую к этому расщеплению. Поэтому необходимо выявить, являются ли все три изучаемые активаторные реакции на начальной стадии свертывания крови результатом воздействия на разные мишени или только на одну. Изначально свертывание крови инициируется в ответ на воспалительную реакцию с активации прекалликреина в калликреин (внутренний путь свертывания), который инициирует каскад свертывания крови — сначала активацию факторов контактной фазы свертывания (ФКФС) - XII и XI, затем белков ПТК, а именно, фактора IX. В дальнейшем, фактор 1Ха активирует фактор Х — предшественник одной из ключевых протеаз системы гемостаза — фактора Ха, специфически превращающего фактор II (протромбин) в фактор На (тромбин) — генератор тромбообразова-ния и регулятор свертывания крови. Одним из основных регуляторов-антикоагулянтов в кровотоке является активированный протеин С, образую-
щийся при участии фактора IIa из своего предшественника — протеина С (рис. 2).
Для выявления мишеней внеклеточных протеаз A. ochraceus L-1 и A. terreus 2 среди белков плазменного гемостаза необходимо последовательно удалить из нормальной плазмы белки ПТК и ФКФС. Отсутствие активаторной активности при инкубации протеаз микромицетов с плазмой, не содержащей ПТК или ФКФС, будет свидетельствовать об их воздействии на белки этих компонентов гемостаза.
На рис. 3 представлены результаты определения остаточной активаторной активности проте-аз A. ochraceus L-1 и A. terreus 2 с плазмой, дефицитной по ПТК. Как видно, выявлены различия в специфичности внеклеточных протеаз этих мик-ромицетов в отношении белков системы гемостаза. Протеазы — активаторы протеина С и фактора X, образуемые A. ochraceus L-1, как и предполагалось, практически не проявили активности с плазмой с удаленным ПТК, что подтверждает предположение об и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.