ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 4, с. 389-397
БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 576.32.36
ВЫЯВЛЕНИЕ мРНК-ТРАНСКРИПТОВ И БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP70 и HSP90 В СЕТЧАТКЕ ВЗРОСЛОГО ТРИТОНА Pleurodeles waltl
© 2013 г. П. П. Авдонин, Ю. В. Маркитантова, В. А. Поплинская, Э. Н. Григорян
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 E-mail: e.grigoryan@hotmail.com Поступила в редакцию 25.10.2012 г.
Исследована экспрессия генов и белков теплового шока в нормальной, неповрежденной сетчатке тритона Pleurodeles waltl методами полимеразной цепной реакции, Вестерн-блот-гибридизации и иммуногистохимии. Показано, что белки HSP70 и HSP90, а также кодирующие их транскрипты соответствующих генов конститутивно экспрессируются в тканях глаза. В сетчатке эти белки распределены дифференциально и обладают экспрессией разного уровня: HSP70 доминирует в наружной сетчатке, а HSP90 — во внутренней, в частности в глиальных клетках Мюллера, а также в зрительном нерве. В ретинальном пигментном эпителии и ростовой зоне глаза — источниках регенерации сетчатки у тритона — также выявлены транскрипты и белки теплового шока HSP70 и HSP90.
DOI: 10.7868/S0002332913040024
Белки теплового шока (heat shock proteins (HSP)) являются молекулярными шаперонами, основная функция которых в нормальных условиях — участие в упаковке и транслокации синтезируемых белков, а также протеолизе деградирующих белков (Parsell, Lindquist, 1993). При тепловом шоке и действии других факторов клеточного стресса конститутивные и стрессиндуцирован-ные HSP, связываясь с частично свернутым белком, стабилизируют его, предотвращая нежелательную агрегацию. При восстановлении нормальных условий в клетке HSP упрощают разворачивание белка и транспорт через мембраны (Borges, Ramos, 2005). Определенную роль HSP играют также в усилении воспалительного ответа. Интерес к этим белкам возрос из-за обнаруженной их связи с различными патологиями и заболеваниями у человека (Arrigo, Simon, 2010; Urbak, Vorum, 2010). Повреждение ткани, ее заживление и сопровождающие воспалительные реакции являются атрибутами регенерационных процессов, поэтому HSP представляют несомненный интерес при исследованиях тканевой регенерации. Известно, что работа fop-генов и активирующих их транскрипционных факторов в процессе регенерации усиливается, а стимулом для этого является повреждение или травма (Totan et al, 2011; Tucker et al., 2011).
В глазу млекопитающих и человека HSP были выявлены в неповрежденных тканях, в частности сетчатке, в нестрессовых условиях (Yamaguchi et al., 1991; Missotten et al., 2003). При этом известно также, что при заживлении и регенерации тканей глаза синтез этих белков существенно увели-
чивается. Это дает основания расценивать данные белки в качестве потенциальных участников регуляции этих процессов (Hong, Lee, 1999; Miyamoto et al., 2003).
Несмотря на небольшое число исследований HSP, выполненных на модельных системах амфибий, их результаты внесли существенный вклад в понимание функции генов, кодирующих эти белки (Heikkila, 2010). Например, показано, что в процессе оогенеза и эмбриогенеза амфибий некоторые hsp-гены экспрессируются конститутивно. Экспрессия же других генов индуцируется только при смене условий, а HSP аккумулируются не во всех, а только в отдельных тканях. По-видимому, участие HSP в развитии позвоночных закономерно, так как их роль выявлена также в эмбриогенезе млекопитающих (Walsh et al., 1997; Akerfelt et al., 2007). Таким образом, HSP не только обладают шаперонной активностью, но и участвуют в процессах эмбриогенеза и регенерации у низших и высших позвоночных животных (Krone, 2003).
Показано, что у хвостатых амфибий на определенных стадиях эпиморфной регенерации происходит up-регуляция генов, кодирующих конкретный класс HSP. Так, при регенерации конечности у аксолотля значительно увеличивается число транскриптов гена hsp70. Это происходит уже через 48 ч после ампутации конечности и поддерживается до начала дифференцировки клеток бластемы образованного регенерата (Levesque et al., 2005). При регенерации выявлена зависимость спектра HSP от характера стресса. На модели регенерации конечности у тритонов обнаруже-
ны различия в наборах HSP разной молекулярной массы у оперированных животных, подвергнутых только травме или дополнительно и тепловому шоку (Tam et al., 1992). Интересно, что при исследовании профиля экспрессии генов hsp в трех регенерирующих системах у рыб (сетчатке, сердце и плавнике) выявлено усиление работы генов, кодирующих hspd1 (heat shock 60-kDa protein 1), а также mps1 (monopolar spindle 1). При этом в сетчатке повышение экспрессии hspd1 наблюдалось как в клетках — источниках регенерации (глиаль-ные клетки Мюллера), — так и в их потомках (Qin et al, 2009).
Хорошо изучена регенерация сетчатки у взрослых тритонов после повреждений, нанесенных разными способами: при полном удалении исходной сетчатки (Mitashov, 1997), перерезке зрительного нерва и сосудов (Миташов, 1970), механической полной отслойке (Григорян и др., 1996; Grigoryan, 2007, 2012). На этих моделях были изучены различные клеточные и молекулярные механизмы восстановления сетчатки (Миташов, 2007; Григорян и др., 2013).
В настоящий момент данных о роли HSP в процессе регенерации сетчатки у амфибий нет. Также нет сведений о присутствии этих белков в нативных тканях глаза тритона, их распределении в стратифицированной сетчатке и в источниках ее регенерации — в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ) и ростовой зоне глаза. Однако есть основания полагать, что HSP могут быть включены в систему регуляторных процессов, определяющих начало и первые этапы регенерации сетчатки у взрослых хвостатых амфибий (Grigoryan, 2012).
В работе впервые идентифицированы мРНК-транскрипты и HSP двух молекулярных масс — средней (HSP70) и высокой (HSP90) — в глазу взрослых хвостатых амфибий, тритонов. Выбор был обусловлен ранее полученными данными, свидетельствующими о присутствии HSP70 и HSP90 у развивающихся амфибий (в том числе тритонов Pleurodeles waltl) (Heikkila, 2010) и об их участии в регенерации у беспозвоночных животных (Patruno et al., 2001). В статье представлены первые сведения об экспрессии генов и белков теплового шока, полученные методами полиме-разной цепной реакции (ПЦР), Вестерн-блот-ги-бридизации и иммуногистохимии в нормальной, неповрежденной сетчатке тритона P. waltl.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На всех этапах работы использовали иглистых тритонов P. waltl, разводимых и содержащихся в условиях аквариальной комнаты ИБР РАН: световой режим — 12 ч свет / 12 ч темнота, температура 23—25°С, кормление мотылем 2 раза в неде-
лю. Содержание и операции проводили в соответствии с биоэтическими правилами ИБР РАН в отношении работы с амфибиями.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов сетчатки взрослых тритонов. У тритонов в возрасте 1 года после анестезии в MS-222 (1 : 1500) были выделены глазные яблоки (всего шесть от трех животных) и фиксированы в 4%-ном формалине. Затем фиксатор отмывали в фосфатном буфере (PBS, pH 7.4), материал пропитывали в 5%-и 20%-ной сахарозе и замораживали в среде OCT (coptinral cutting temperature) в жидком азоте. Далее готовили криосрезы (10 мкм), которые окрашивали антителами. Срезы отмывали в фосфатном буфере (PBS, pH 7.4) 30 мин, обрабатывали раствором 0.25%-ного Triton X-100 с 0.1%-ным Tween-20 на 100 мМ PBS, и выдерживали 60 мин в блокирующем растворе (3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) фирмы "Sigma" (США) на 100 мМ PBS). Реакцию с первыми антителами проводили в содержащем 3% BSA блокирующем растворе при 4°С в течение 12 ч. Срезы отмывали в 100 мМ PBS, после чего инкубировали (60 мин) со вторыми антителами. Первичными антителами служили моноклональные мышиные антитела против HSP70 и HSP90 (Sigma), разведенные на блокирующем растворе в рабочей концентрации 1 : 500. Вторичными антителами был мышиный, FITC-меченный иммуноглобулин (полная молекула) в разведении 1 : 250. После окрашивания срезы отмывали в PBS и заключали под покровные стекла в смесь глицерина и PBS (9 : 1) с добавлением протектора окрашивания DABCO (Sigma). В ряде случаев докрашивали ядра клеток с помощью Hoechst (1 мкл в 1 мл PBS, 5—10 мин) (Biotium, США). Специфичность иммунореак-ций проверяли в отсутствие первых антител, а также с использованием разных каналов флуоресценции. Картины иммунофлуоресценции анализировали с помощью микроскопа Leica DM RXA2 (Leica Microsystems, Германия), оснащенного компьютерной приставкой и программой Leica for Windows. Анализ изображения проводили с помощью программы Image J (NIH, США).
ПЦР-анализ сетчатки глаза тритона P. waltl. Выделенные у тритонов (12 особей, 1 год) глазные яблоки (всего 24) помещали в буфер (0.1 М PBS, pH 7.4). Из глаз микрохирургически изолировали передний сектор, а из заднего сектора получали сетчатку, которую помещали в холодный 0.1 М PBS. Образцы сетчаток переносили в раствор TRI Reagent (MRC, США) для выделения тотальной РНК, проводимого согласно протоколу, прилагаемому к этому раствору. От примесей геномной ДНК образцы освобождали обработкой ферментом DNase Turbo (Ambion, США) согласно протоколу, далее проводили экстракцию тотальной РНК фенол-хлороформом и осаждали спиртом. Осадок растворяли в воде, свободной от РНКаз.
Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием наборов Omniscript RT Kit (Quiagen, Германия) и High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкциями. В результате был проведен синтез кДНК библиотек интактной сетчатки. Праймеры для ПЦP конструировали с помощью программ Primer Select (DNASTAR, США), Beacon Designer (Premier Biosoft International, США) на основе нуклеотидных последовательностей, аннотированных в международной базе данных (Gene Bank), и online-программы для сравнительного анализа нуклеотидных и белковых последовательностей (BLAST), размещенных на сервере NCBI. Продукты ПЦ^ полученные с использованием специфических праймеров к нуклеотидной последовательности hsp70 и hsp90, секвенирова-ли. Процедура секвенирования выполнялась в компании СИНТОЛ Ро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.