БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 1, с. 138-142
УДК 57.017.23
ВЫЯВЛЕНИЕ ОБОНЯТЕЛЬНОГО МАРКЕРНОГО БЕЛКА В ТКАНЯХ С ЭКТОПИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ
РЕЦЕПТОРОВ
© 2010 г. Е. Н. Буданова, М. Ф. Быстрова
Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, ул. Институтская 3; факс: (4967)330509; электронная почта: mbistrova@icb.psn.ru Поступила в редакцию 16.06.2009 г.
Обонятельный маркерный белок ОМР является маркером зрелых обонятельных нейронов — клеток, которые специализируются в распознавании пахучих стимулов и с этой целью специфически экспрессируют гены обонятельных рецепторов. Интересно, что транскрипты генов обонятельных рецепторов также были обнаружены в различных тканях, не связанных с обонятельной функцией. Этот феномен является примером эктопической экспрессии генов, и его физиологическое значение остается непонятным. В данной работе мы поставили целью проверить наличие ОМР в тканях, для которых была показана эктопическая экспрессия генов обонятельных рецепторов, а именно в семенниках и во вкусовой ткани. Поликлональные антитела, полученные к рекомбинантному ОМР, были использованы для иммуногистохимического окрашивания срезов ткани семенников и желобоватых вкусовых сосочков языка крысы. Впервые было показано присутствие ОМР во вкусовых почках крысы. На срезах семенников иммунореактивности обнаружено не было.
Ключевые слова: обонятельные рецепторы, обонятельный маркерный белок, эктопическая экспрессия генов.
Обонятельный маркерный белок (Olfactory Marker Protein, ОМР) является маркером зрелых обонятельных рецепторных нейронов - клеток, физиологической функцией которых является детекция молекул запахов, усиление сигнала, его кодирование в форме электрических импульсов и передача информации в обонятельную луковицу для ее дальнейшей обработки [1]. ОМР — мажорный цитозольный белок с молекулярной массой 19 кДа, который синтезируется в зрелых обонятельных нейронах и путем аксонального транспорта попадает в обонятельную луковицу [2]. Зрелыми считаются нейроны, аксоны которых установили контакты с мишенями в обонятельной луковице. Этот белок локализован во всех частях обонятельного нейрона, в цилиях, в соме, в аксоне, и по количеству мРНК транскриптов в этих клетках ОМР является одним из наиболее представительных. ОМР был впервые выделен и охарактеризован биохимически более 30 лет назад, однако его физиологическая роль в обонятельной системе до сих пор точно неизвестна [3]. Предполагается, что ОМР может модулировать процесс трансдукции обонятельного сигнала. Так, у мышей с нокаутированным геном отр наблюдалось выраженное уменьшение амплитуды электрооль-фактограммы, а также измененные поведенческие реакции, ассоциированные с детекцией и распознаванием запахов [4—6]. Сравнительный
анализ физиологической активности одиночных обонятельных нейронов, выделенных из мышей дикого типа и с нокаутированным геном отр, позволил предположить, что ОМР принимает участие в формировании кинетики обонятельных ответов [7]. Кроме того, существует гипотеза, что ОМР вовлечен в контроль нейрогенеза обонятельных нейронов, которые обновляются даже при нормальных физиологических условиях в течение всей жизни животного за счет популяции базальных прогениторных клеток обонятельного эпителия [8—10]. Экспериментальные данные указывают, что ОМР является митогеном и усиливает процесс клеточного деления в обонятельном эпителии. Митогенные свойства рекомби-нантного ОМР были продемонстрированы на ор-ганотипической культуре эмбрионального обонятельного эпителия [9], а также для обонятельного эпителия крысы в экспериментах in vivo [10].
В обонятельной системе позвоночных ОМР был найден только в хеморецепторных клетках, экспрессирующих гены рецепторов запахов или феромонов. Интересно, что транскрипты генов обонятельных рецепторов, образующих самое большое семейство в геноме человека и других млекопитающих, были также обнаружены в различных тканях, не связанных с обонятельной функцией [11]. Этот феномен является ярким
ВЫЯВЛЕНИЕ ОБОНЯТЕЛЬНОГО MАPKЕPНОГО БЕЛКА
139
примером эктопической экспрессии генов [12]. Хотя все клетки многоклеточного организма содержат одинаковый набор генов, их отличие друг от друга, определяющее функциональную специализацию каждой клетки, зависит от того, какие именно гены они экспрессируют. Экспрессия генов в многоклеточном организме находится под строгим контролем, определяющим соответствие профиля транскриптов генов в клетке ее функциональному профилю. Термин "эктопическая" определяет экспрессию гена в тех клетках, где он не может выполнять известную для него специфическую функцию [11, 12]. Исследования по глобальному скринингу транскриптов генов в различных тканях и клетках с применением технологии микроматриц показали, что эктопическая экспрессия является широко распространенным феноменом. Функциональное значение этого феномена кажется непонятным, поскольку трудно объяснить, зачем клеткам тратить ресурсы на экспрессию функционально ненужного материала. Имеется предположение, что эктопическая экспрессия может иметь эволюционный потенциал [12].
Первоначально эктопическая экспрессия генов обонятельных рецепторов была обнаружена в ткани семенников и мужских половых клетках млекопитающих, рыб и птиц [13—15], а также во вкусовой ткани языка [16, 17]. Более поздние исследования с применением микроматриц показали присутствие транскриптов этих генов в разнообразных тканях человека и мыши, включая кожу, сердце, печень, плаценту, мозг, тимус, поджелудочную железу и др. [11]. Эктопическая экспрессия обонятельных рецепторов в семенниках и вкусовой ткани носит функциональный характер, хотя эта функция и отличается от основополагающей специфической функции обонятельных рецепторов в обонятельном эпителии. Предполагается, что обонятельные рецепторы являются медиаторами хемотаксиса сперматозоидов [18, 19], а также вовлечены в процессы хемо-рецепции во вкусовой ткани [16, 17].
Поскольку ОМР является маркером клеток, содержащих функциональные обонятельные рецепторы, целью данной работы было проверить присутствует ли этот белок в тканях, для которых была показана функциональная эктопическая экспрессия генов обонятельных рецепторов, а именно в семенниках и во вкусовой ткани.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Создание экспрессионного вектора и получение рекомбинантного белка. Полноразмерная последовательность кДНК, кодирующая ОМР крысы, была наработана с помощью одноступенчатой ОТ-ПЦР (набор One-Step RT-PCR with Platinum Taq Hi-Fi, "Invitrogen") в соответствии с реко-
мендациями производителя и с использованием ген-специфических праймеров. В качестве матрицы использовалась тотальная РНК, выделенная из ткани обонятельного эпителия с применением RNeasy RNA isolation kit "Qiagen", следуя протоколу производителя. Прямой праймер (ATAGAATTCGGCAGAGGACGGGC) содержал последовательность, входящую в участок узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI, обратный (ATTGTaGACTCAGAGCTGGTTAAA-CAC) — участок узнавания Sali. Фрагмент ПЦР обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRI и SalI и клонировали по соответствующим сайтам в вектор рЕТ28Ь(+) ("Novagen"). Рекомбинант-ной плазмидой трансформировали клетки E. coli Rosetta TM. Синтез рекомбинантного белка индуцировали добавлением ß-изопропилтиогалак-тозида (ИПТГ) до 1 hM. Клетки осаждали центрифугированием, осадок переводили в буфер (0.05 M NaH2P04/0.5 M NaCl/0.01 M имидазол, рН B.0). Суспендированные клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе, лизат осветляли центрифугированием. Супернатант фильтровали через шприцевой фильтр (0.22 мкм, "Corning", США) и наносили на колонку с Ni-NTA агарозой ("Invitrogen"). Mеталлоаффинную хроматографию проводили по протоколу производителя Ni-NTA агарозы ("Invitrogen").
Получение поликлональньх антител. Кролика иммунизировали подкожно 300 мкг рекомбинантного ОMP в полном адъюванте Фрейнда ("Sigma-Aldrich"). Повторную иммунизацию проводили через 14 дней тем же количеством антигена в неполном адъюванте. Через десять дней брали кровь из ушной вены и получали антисыворотку. Титр антител в антисыворотке определяли твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА).
Электрофорез и иммуноблотинг. Белки разделяли электрофорезом на 12.5%-ном SDS-полиа-криламидном геле по методу Лэммли [20]. Очищенный рекомбинантный ОMP или ткань обонятельного эпителия cолюбилизировали в двухкратном буфере для нанесения образца, содержащем 125 mM трис-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 20% глицерина, 0.02% бромфенолового синего, 10% ß-меркаптоэтанола. В качестве маркеров использовали коммерческие белки "Protein molecular weight marker" ("Fermentas"). Окрашивание геля проводили Кумасси R—250 ("Fluka"). Для иммуноблотинга белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану ("Amersham"), используя прибор для полусухого блотинга ("BioRad"). Неспецифическую сорбцию блокировали 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в трисовом буфере (0.02 M трис-На/0.1 M NaCl/0.05%-Tween 80, pH 8.0). Затем проводили инкубацию мембраны с антисывороткой в разведении 1/12000 в течение 1 ч при 37°С.
140
БУДАНОВА, БЫСТРОВА
кДа а кДа б
116 66.2 п 116 _ 66.2 —
45 щ 45 —
35 1 35 —
25 т щт 25 —
18.4 18.4 —
14.4
1 2
Рис. 1. Проверка специфичности антител к ОМР. а — SDS-гель-электрофорез препарата очищенного рекомбинантно-го ОМР, использованного для иммунизации кролика. 1 — Белки-маркеры; 2 — рекомбинантный ОМР. Окраска геля Кумасси К—250. б — Вестерн-блотинг суммарных белков обонятельного эпителия крысы, разделенных электрофорезом на 12.5%-ном SDS-полиакриламидном геле, с антисывороткой против рекомбинантного ОМР. Слева показано положение белков-стандартов.
В качестве вторичных использовали антикроличьи антитела козы, конъюгированные с щелочной фосфатазой ("Promega"), в разведении 1 : 3000. Связавшиеся антитела проявляли с использованием стабилизированного субстрата для щелочной фосфатазы Western-Blue ("Promega").
Иммунногистохимия. Ткань обонятельного эпителия крысы фиксировали в 4%-ном пара-формальдегиде/0.25% глутаровом альдегиде. Обезвоженный образец заливали в смесь Histomix. Депарафинизированн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.