МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 483-492
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.214.622+577.27
ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В МОЛЕКУЛЕ ФИБРИЛЛАРИНА, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ЕГО СПЕЦИФИЧЕСКУЮ ЛОКАЛИЗАЦИЮ В ЯДРЫШКАХ КЛЕТОК ИеЬа
© 2004 г. С. А. Левицкий1, К. Ш. Мухарьямова2, В. П. Вейко1, О. В. Зацепина2' 3' *
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 2Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук,
Москва, 117997
3Научно-исследователъский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 Поступила в редакцию 22.08.2003 г.
Фибрилларин - один из основных белков ядрышка, который принимает участие в созревании транс-криптов предшественников рибосомных РНК (пре-рРНК). В составе его молекулы выявляются три основных домена - ОДЯ-домен, ЯБ-домен и а-спиральный участок, предположительно обладающий метилтрансферазной активностью. Однако роль этих районов в обеспечении специфической локализации фибрилларина в ядрышке до сих пор остается не выясненной. Для исследования этого вопроса нами создана серия плазмидных векторов, несущих гены мутантных форм фибрилларина человека, слитых с зеленым флуоресцирующим белком, и изучена локализация рекомбинантных слитых белков в интерфазных и митотических клетках ИеЬа после однократной трансфекции клеток плазмидами. Показано, что делеции или мутации в любом домене фибрилларина нарушают его специфическую, соответствующую местам синтеза пре-рРНК локализацию внутри ядрышка. В то же время, наличие ОДЯ-домена и первого спейсера оказывается достаточным для миграции фибрилларина в ядрышко. Мутантные формы фибрилларина, располагающиеся внутри ядрышка в интерфазе, практически не отличаются от фибрилларина дикого типа по характеру локализации во время митоза.
Ключевые слова: клетки ИеЬа, ядрышко, фибрилларин, мутагенез.
Основной известной функцией фибрилларина -специфического белка ядрышка (34-36 кДа, р1 8.5-10), называемого также КОР1 [1] - у дрожжей и В-36 - в низших растениях [2-4], является участие в процессинге транскриптов новообразованных 45-478 пре-рРНК, их метилировании и в биогенезе рибосом [5]. Он относится к наиболее консервативным клеточным белкам, степень гомологии которого в филогенетически отдаленных видах достигает 80%. Фибрилларин и его гомологи описаны у многих видов млекопитающих [6, 7], амфибий [8], низших [2-4] и высших [9, 10] растений, дрожжей [5], простейших [11], а также у архебак-терий [12]. Фибрилларин - обязательный компонент малых ядрышковых РНП (мякРНП), отно-
Принятые сокращения: GAR (glycine and arginine-reach) -глицин- и аргинин-богатый домен, RB (RNA-binding) -РНК-связывающий домен, рРНК - рибосомная РНК, рДНК - рибосомная ДНК, мякРНК (мякРНП) - малые яд-рышковые РНК (РНП), NLS - сигнал(ы) ядерной локализации, NoLS - сигнал(ы) ядрышковой локализации, PCR -полимеразная цепная реакция, GFP - зеленый флуоресцирующий белок, ПФА - параформальдегид.
* Эл. почта: zatsepina_olga@mail.ru; zatsepin@ibch.ru
сящихся к C/D-классу, которые необходимы для процессинга транскриптов пре-рРНК и их посттранскрипционных модификаций за счет специфического 2'-0-метилирования рибозы в 18S и 28S рРНК [13-15]. Установлено, что фибрилларин непосредственно взаимодействует, по крайней мере, с двумя мякРНК - U16 амфибий [16] и U14 дрожжей [17]. Кроме того, он входит в состав макромолекулярных комплексов, содержащих некоторые участвующие в процессинге рРНК белки ядрышка [18], а в дрожжевой двухгибрид-ной системе взаимодействует с ядерным белком DEAD (p68) - РНК-хеликазой [19].
Интерес к изучению фибрилларина вызван также тем обстоятельством, что у ~ 8% больных аутоиммунными заболеваниями вырабатываются антитела к фибрилларину или его комплексу с мякРНК [20-22], а в некоторых линиях мышей выработка таких антител может быть индуцирована экспериментально с помощью солей серебра [23] или ртути [24, 25].
В норме внутри ядрышка фибрилларин располагается в тех его участках, где происходит транс-
483
8*
Таблица 1. Мутантные генетические конструкции белка фибрилларина, маркированные ОБР, и локализация продуктов их экспрессии в клетках ИеЬа
Название и размер Схема структуры гена фибрилларина Локализация
конструкции Ц Н ЯК ФТр
Дикий тип (pfibr/GFP) (321 а.о.) GAR 1 RB 2 а 8 80 133 222 274 306 - - + +
pSRB/GFP (321 а.о.) «шш-1 1-■- - + - -
pA2a/GFP (222 а.о.) ШШ»- - + + -
pGAR1/GFP (133 а.о.) «ш— - + + -
pARB/GFP (232 а.о.) -«Ш1-■- -/+ + -/+ -
p2a/GFP (84 а.о.) -■ + + - -
Ц - цитоплазма, Н - нуклеоплазма, ЯК - ядрышко, ФТр - фокусы транскрипции.
крипция рДНК и процессинг новосинтезированных транскриптов пре-рРНК. На электронномикро-скопическом уровне эти участки соответствуют, преимущественно, плотному фибриллярному компоненту ядрышка [3, 4, 26]. Кроме того, фибрилла-рин входит в состав телец Кахала (coiled bodies) -внеядрышковых образований, основной функцией которых, по-видимому, является процессинг мРНК [27], а также колокализуется с нуклеоплаз-матическими протеасомами [28] и скоплениями вирусных белков в ядрах клеток, зараженных ци-томегаловирусом [29]. Эти наблюдения косвенно указывают на то, что фибрилларин может выполнять функции, отличные от биогенеза рибосом в ядрышке - например, принимать участие в процессинге мРНК или протеолизе ядерных белков [28].
У человека молекула фибрилларина состоит из 321 аминокислотного остатка (а.о.) и содержит три основных структурных домена [6] (табл. 1). N-концевую часть молекулы составляет глицин и аргинин-богатый участок (GAR-домен), включающий ~80 а.о., который может содержать сиг-нал(ы) ядерной локализации (NLS), а также последовательности, обеспечивающие связь фибрилларина с другими белками [30, 31]. Центральный участок фибрилларина (~90 а.о.) содержит мотивы, родственные РНК-связывающим последовательностям различных белков, входящих в состав малых ядерных РНП (мяРНП) [5]. C-кон-цевая часть молекулы содержит короткий (~32 а.о.) а-спиральный участок, который, предположительно, обладает метилтрансферазной активностью [12]. Однако роль основных доменов фибрилларина в обеспечении его специфической локализации внутри ядрышка, соответствующей местам новообразования пре-рРНК, остается невыясненной. С одной стороны, известно, что сигналы, достаточные для ядрышковой локализации
(NoLS), могут располагаться внутри GAR- и/или РНК-связывающих (RB) участков таких специфических белков ядрышка, как нуклеолин [32, 33] и РНК-хеликаза [34]. В частности, было показано, что GAR-район фибрилларина необходим и достаточен для миграции белка в ядрышки у ара-бидопсиса [10]. С другой стороны, согласно недавним данным Снаар и соавт. [27], специфическое расположение фибрилларина в ядрышках клеток человека, главным образом, определяется наличием а-спирального участка и второго спей-сера, тогда как GAR-домен не играет значительной роли в накоплении белка в ядрышке. До сих пор отсутствуют данные о поведении мутантных форм фибрилларина во время митоза, когда ядрышко распадается и значительная часть его белков, включая фибрилларин, распределяется по цитоплазме в метафазе, а в телофазе вновь мигрирует в новообразующиеся ядрышки [35-37].
Целью настоящей работы было создание ряда экспрессионных векторов, несущих гены мутантных форм фибрилларина человека, слитых с геном маркерного зеленого флуоресцирующего белка (GFP), и изучение локализации химерных белков в интерфазных и телофазных клетках HeLa.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Культуру клеток человека HeLa выращивали на покровных стеклах, находящихся в чашках Петри, в среде ДМЕМ, содержащей 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глута-мин и антибиотики, при 37°С и 5% СО2.
Получение плазмид, несущих гены мутантных форм фибрилларина, слитых с геном белка GFP.
Фрагменты гена, кодирующего белок фибрилларин, соответствующие GAR1, РНК-связывающе-му и а-спиральному участкам, получали с помощью PCR-амплификации с использованием соот-
ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В МОЛЕКУЛЕ Таблица 2. Олигонуклеотиды, использованные для амплификации участков гена фибрилларина
Амплифицируемый фрагмент гена фибрилларина Наименование олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида 5'—3'
GAR1 (нуклеотиды 1-416) FlBN C CGTCAGATCCGCTAGCGC
FRBR GGGGTCTGCAGCACTAGTCTCAAATTTGTCATCTCC
2 a (нуклеотиды 647-1024) FRBL TGCTAAGCTTATGACTAGTTACCGCATGCTCATCGC
FlBC TTGCTCACCATGGTGGCG
GAR1 + RB (нуклеотиды 1-676) FlBN C CGTCAGATCCGCTAGCGC
FA2D A GCACTGCAGATTTGTGTGGGTGT C GAGC
SRB (нуклеотиды 1-491) FlBN C CGTCAGATCCGCTAGCGC
FRDC GAGAACCTTCGAGCCCCCGGTTTGATG
SRB (нуклеотиды 436-1024) FRDN TGGAACCTTCCGCTCCAAGCTAGCAGC
FlBC TTGCTCACCATGGTGGCG
ветствующих пар праймеров (см. табл. 2). Использованные олигонуклеотиды содержали сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции HindIll и Sall ("MBl Fermentas", Литва). В качестве матрицы использовали конструкцию, несущую ген белка фибрилларина, слитого с геном белка GFP (pfi-br/GFP), любезно предоставленную М.О.Дж. Олсо-ном (M.O.J. Olson, США). Полученные фрагменты гена фибрилларина расщепляли эндонуклеазами Hindlll и Sall и клонировали в плазмиду pEGFP-N3 ("Clontech", США; ниже - рGFP) по соответствующим сайтам рестрикции. Для получения конструкции pSRB/GFP амплифицировали фрагменты 407-1023 и 1-490 гена фибрилларина, используя пары олигонуклеотидов FRDN-FIBC и FRDC-FIBN, соответственно (табл. 2). При этом олиго-нуклеотид FRDN обусловливал делецию нуклео-тидов С414 и С415, а FRDC - инсерцию CG между 481 и 482 нуклеотидами. Данные фрагменты использовали в качестве мегапраймеров для получения полноразмерного мутантного гена фибрил-ларина. В результате получен ген, кодирующий мутантную форму фибрилларина, в котором аминокислотная последовательность части РнК-свя-зывающего домена 139-PFRSKLAAAILGGVDQI-HIKPGA-161 заменена на 139-LPLQASSSNPG-WCGPDPHQTGGS -161. Синтезированный таким образом ген расщепляли эндонуклеазами Hindlll и Sall и клонировали в составе плазмиды рGFP. Конструирование плазмиды pARB/GFP о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.