МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 617-627
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.29
ВЫЯВЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ KRAS, BRAF,, PIK3CA У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ С ПОМОЩЬЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ
© 2015 г. М. А. Емельянова1, 2, 3*, Ф. А. Амосенко3, 4, А. В. Семьянихина3, В. А. Алиев3, Ю. А. Барсуков3, Л. Н. Любченко3, Т. В. Наседкина1, 2
1Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ", Москва, 117312 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Москва, 115478 4Медико-генетический научный центр, Москва, 115478 Поступила в редакцию 19.11.2014 г.
Принята к печати 26.12.2014 г.
Соматические мутации в генах KRAS, PIK3CA и BRAFобуславливают нечувствительность клеток коло-ректального рака к терапии анти-ЕСГК-моноклональным антителами, поэтому до назначения терапии необходимо проведение генетического тестирования опухоли. Разработан и валидирован биологический микрочип, позволяющий выявлять 19 клинически значимых соматических мутаций в генах KRAS, BRAFи PIK3CA. Метод включает полимеразную цепную реакцию с блокированием амплификации последовательностей дикого типа и последующую аллель-специфичную гибридизацию на биочипе и выявляет 1% мутантной ДНК на фоне ДНК дикого типа. С помощью этого подхода проанализированы 66 образцов ДНК, выделенных из образцов колоректального рака. Проведен анализ ассоциаций между генетическим статусом опухоли и характеристиками больных (возраст, пол, локализация опухоли, стадия, TNM). Мутации в гене KRAS чаще встречались у женщин (Р = 0.02), а также у больных с отдаленными метастазами (Р = 0.04). Других ассоциаций между наличием мутаций и характеристиками больных не выявлено. Разработанный высокочувствительный метод определения соматических мутаций может быть использован в онкологической практике для отбора больных, чувствительных к терапии анти-EG-FR-моноклональным антителами.
Ключевые слова: соматические мутации, КЯА8, Р1К3СА, БЕА£, колоректальный рак, биочипы, блокирующая ПЦР.
DETECTION OF SOMATIC MUTATIONS IN KRAS, BRAF AND PIK3CA GENES IN COLORECTAL CANCER PATIENTS USING BIOCHIPS, by M. A. Emelyanova1'2 3, F. A. Amossenko3' 4, A. V. Semyani-khina, V. A. Aliev3, Y. A. Barsukov3, L. N. Lyubchenko3, T. V. Nasedkina1, 2 (1Limited Liability Company "BIOCHIP-IMB", Moscow, 117312 Russia, *e-mail: emel_marina@mail.ru; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, 115478 Russia; 4Research Center for Medical Genetics, Moscow, 115478 Russia). Somatic mutations in KRAS, PIK3CA and BRAF genes cause insensitivity of colorectal tumors to the therapy with anti-EGFR monoclonal antibodies, therefore the genetic testing is necessary before the chemotherapy. Biological microchip has been developed and validated which allows detecting of 19 different somatic mutations in KRAS, PIK3CA and BRAF genes. The method is based on combination of LNA-clamp PCR and allele-specific hybridization with biochip and allows detecting at least 1% of mutated DNA in the background of wild type DNA. Using biochips 66 DNA samples isolated from colorectal tumor tissues were investigated. Statistical analysis has been performed to investigate associations between tumor genetic status and characteristics of a patient (age, sex, tumor localization, tumor stage, TNM). It was found that KRAS gene mutations occurred mainly in females (P = 0.02). Also KRAS gene mutations were more frequent in patients with distant metastases (P = 0.04).
Принятые сокращения: KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) — ген малой ОТРазы, гомолог вирусного онкогена саркомы крыс Кирстен; PIK3CA (alpha catalytic subunit of phosphatidylinositol 3-kinase) — ген каталитической субъединицы фосфатидилинозитол-3-киназы; BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B) — ген серин/треониновой проте-инкиназы, гомолог В вирусного онкогена саркомы мышей v-raf; EGFR (epidermal growth factor receptor) — ген рецептора фактора роста эпидермиса; ERK (extracellular signal-regulated kinase) — киназа, регулируемая внеклеточным сигналом; mTOR (mammalian target of rapamycin) — серин/треониновая протеинкиназа, мишень рапамицина в клетках млекопитающих.
* Эл. почта: emel_marina@mail.ru
Other associations between the presence of mutations and patient characteristics were not found. The developed highly sensitive method for somatic mutation analysis may be used in oncological practice for the selection of patients sensitive for the therapy with anti-EGFR monoclonal antibodies.
Keywords: somatic mutations, KRAS, PIK3CA, BRAF, colorectal cancer, biochip, LNA-clamp PCR. DOI: 10.7868/S0026898415040035
Термин рак толстой кишки (колоректальный рак, КРР) объединяет различные по форме, локализации и гистологической структуре злокачественные эпителиальные опухоли ободочной и прямой кишки. КРР стабильно занимает третье место в мире по встречаемости и смертности среди всех онкологических заболеваний как у мужчин, так и у женщин [1]. В Российской Федерации ежегодно выявляется около 57000 новых случаев этого заболевания [2]. На момент постановки диагноза не более 20% больных имеют I—II стадии заболевания, у каждого третьего присутствуют отдаленные метастазы. У 40—60% больных, которым была проведена радикальная операция, происходит дальнейшее распространение процесса. Таким образом, значительному числу больных требуется проведение лекарственной терапии. В последнее десятилетие одним из крупнейших достижений в терапии онкологических заболеваний стала разработка препаратов направленного действия. К таким препаратам, необходимым для эффективной терапии метастатического КРР, относятся химерные (человек/мышь) IgG1 моноклональ-ные антитела цетуксимаб (Эрбитукс) и гуманизированные (полностью человеческие) IgG2 моно-клональные антитела панитумумаб (Вектибикс) [3, 4]. Антитела обоих типов связываются с внеклеточным доменом рецептора эпидермального фактора роста (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), активированного в эпителиальных опухолях, и блокируют передачу необходимых для пролиферации опухолевых клеток сигналов по внутриклеточным EGFR-зависимым каскадам белков-эффекторов RAS/RAF/ERK и PI3K/AKT/mTOR. В ходе клинических испытаний было установлено, что соматические мутации в ряде эффекторов EGFR (KRAS, BRAF, PIK3CA) могут влиять на восприимчивость опухоли к анти-EGFR-монокло-нальным антителам. Мутации в генах KRAS, PIK3CA и BRAF при КРР выявляют с частотой 32—43, 15—20 и 6—12% соответственно [5—7].
В многочисленных исследованиях показано, что мутации в гене KRAS существенно уменьшают эффективность терапии цетуксимабом или пани-тумумабом [8—10], поэтому назначение этих препаратов показано только больным с KRAS дикого типа (wtKRAS) [11, 12]. Значимость наиболее распространенной мутации V600E в гене BRAF и мутаций в гене PIK3CA в терапии анти-EGFR-моно-
клональными антителами при КРР активно изучается. Установлено, что у больных с мутациями в BRAF и Р1К3СА снижен ответ на анти-EGFR-те-рапию, в том числе у носителей wtKRAS [13—18]. Наличие активирующих мутаций в генах белков-эффекторов EGFR служит основанием для выбора других мишеней для таргетной терапии, например фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), важнейшего регулятора физиологического и патологического ангиогенеза. Ингибирование VEGF с помощью гуманизированных моноклональных антител (бевацизумаб, авастин) позволяет добиться положительного ответа на терапию у больных с мутациями в генах KRAS и BRAF [19]. У больных КРР с мутациями в гене BRAF можно использовать ве-мурафениб, ингибитор протеинкиназы BRAF [20].
Мутации в гене PIK3CA у больных КРР рассматриваются в качестве биомаркера, ассоциированного с положительным ответом на дополнительную терапию аспирином [21, 22]. Кроме того, носители мутаций KRAS, BRAF и PIK3CA имеют худшие показатели общей выживаемости, чем больные без мутаций, что позволяет рассматривать эти мутации в качестве прогностических факторов [23, 25]. Таким образом, обнаружение активирующих мутаций в генах KRAS, BRAF и PIK3CA важно для прогноза КРР и эффективности его терапии в современной клинической онкологии.
Одна из основных проблем выявления соматических мутаций — гетерогенность клинических образцов, которые часто содержат смесь раковых и нормальных клеток. Поэтому опухолевый материал необходимо анализировать с использованием метода, который позволяет выявлять мутант-ную ДНК на фоне преобладания ДНК дикого типа. С этой целью в настоящее время применяют прямое секвенирование по Сэнгеру, пиросекве-нирование, аллель-специфичную ПЦР в реальном времени, ПЦР с блокированием амплификации последовательностей дикого типа, анализ кривых плавления высокого разрешения с секве-нированием [26—29]. Эти методы имеют не только существенные достоинства, но и некоторые недостатки. Прямое секвенирование не обладает достаточной аналитической чувствительностью, другие методы не позволяют одновременно анализировать множество мутаций, что увеличивает материальные и временные затраты при проведении генетического тестирования. Особую трудность
представляет анализ мутаций в гене PIK3CA, поскольку в геноме человека есть участки, характеризующиеся высокой гомологией (до 97%) экзо-нам этого гена (9, 11—13, частично 10) [30].
Нами разработан высокочувствительный метод, позволяющий проводить одновременный параллельный анализ соматических мутаций в ключевых генах EGFR-зависимых сигнальных путей. Метод основан на использовании мультиплексной гнездовой ПЦР с последующей аллель-специфичной гибридизацией на биологическом микрочипе. В ходе ПЦР происходит блокирование амплификации последовательностей дикого типа за счет связывания с олигонуклеотидными зондами, содержащими LNA (locked nucleic acid), что позволяет добиться существенного обогащения образца мутантными последовательностями, даже если мутации содержит небольшой процент клеток. Ранее мы использовали данный подход при разработк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.