МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 793-800
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 577.152.651.14:577.113.5:577.343.113
ВЫЯВЛЕНИЕ ТРИНУКЛЕОТИДНОЙ ДЕЛЕЦИИ АР508 В ГЕНЕ СЕТЯ ЧЕЛОВЕКА ПУТЕМ УФ-ИММОБИЛИЗАЦИИ НА КАПРОНЕ КОМПЛЕКСА ПЦР-ФРАГМЕНТА С ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫМ ЗОНДОМ
© 2003 г. М. Р. Кабилов12*, Д. В. Пышный1, Г. М. Дымшиц2, В. Ф. Зарытова1, Е. М. Иванова1
Новосибирский институт биоорганической химии Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск, 630090,
2Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 24.02.2003 г.
Исследована возможность выявления делеции АР508 в ПЦР-фрагментах участка гена СГТЯ человека методом колориметрической детекции УФ-иммобилизованного на капроне гибридизационного комплекса ДНК, получаемого с помощью лигирования тандема коротких олигонуклеотидов на ДНК-матрице. Предлагаемый метод позволяет с высокой достоверностью выявлять тринуклеотид-ную делецию (вставку). Уровень неспецифического сигнала зависит от нуклеотидного состава био-тинилированного компонента тандема. Уровень специфического сигнала достоверен при использовании в анализе ПЦР-фрагментов различной длины (200-400 п.н.) независимо от расположения сайта связывания тандема в их последовательности.
Ключевые слова: ДНК-диагностика, молекулярная гибридизация, УФ-иммобилизация, точковая мутация, делеция АБ508, ген СГТЯ, муковисцидоз, тандемы олигонуклеотидов, лигирование, ДНК-лигаза фага Т4, биотин-стрептавидиновая система.
Разработка новых подходов, позволяющих достоверно выявлять точечные мутации в генетическом материале, актуальна для медицинской диагностики и популяционной генетики. В последние годы наибольшее развитие получают методы с использованием ДНК-чипов [1, 2] - наборов олигонуклеотидов, иммобилизованных на слайдах. Преимуществом таких технологий является возможность их использования для быстрого и массового анализа нуклеиновых кислот. Однако до сих пор ни одна из таких разработок не нашла широкого практического применения в ДНК-диагностике, что обусловлено несколькими причинами. Во-первых, микрочиповая технология требует дорогостоящего оборудования как для производства микрочипов, так и для проведения анализа и считывания информации [1]. Во-вторых, достоверное выявление точечных мутаций при анализе ДНК на биочипе осложняется тем, что гибридизация проводится с набором иммобилизованных олигонуклеотидов, обладающих различной гиб-ридизационной способностью. Поскольку гибри-
Принятые сокращения: префикс "d" в аббревиатуре олиго-дезоксирибонуклеотидов опущен; CFTR - Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза), Bio - биотин; BCIP - 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат, толуидиновая соль; NBT - тетразолиум нитроголубой; DMFA - ^^диметилформамид.
* Эл. почта: pyshnyi@niboch.nsc.ru
дизация анализируемой ДНК с такими олигонук-леотидами происходит одновременно и в одних и тех же условиях, практически невозможно добиться высокой селективности анализа. Другими словами, дискриминация фрагментов ДНК, отличающихся на одно нуклеотидное звено, становится трудно достижимой [2]. Необходима разработка подходов, которые позволили бы повысить селективность узнавания молекул ДНК. Одним из таких подходов является использование на биочипах ДНК-лигаз [3, 4], поскольку они обладают высокой чувствительностью к некомплементарным нуклеотидам вблизи лигируемого одноцепо-чечного разрыва дуплекса [5-8].
В нашей предыдущей работе [9] предложен новый, простой в исполнении и коммерчески доступный подход к выявлению ДНК-амплифика-та, который позволяет не только детектировать анализируемую ДНК, но и с высокой достоверностью определять в ее последовательности однонук-леотидные замены. Подход основан на высокоселективном матричном лигировании в растворе трех коротких олигонуклеотидов - центрального тетрамера и фланкирующих его октамеров - с последующим колориметрическим выявлением образующегося гибридизационного комплекса ДНК ■ (продукт лигирования) после его УФ-им-мобилизации на капроне.
\
мутация
тандем олигонуклеотидов
биотин _
ДНК-фрагмент
-ог
щелочная фосфатаза
стрептавидин-»- f »'S
УФ-облучение
хромогенные субстраты
x
лигаза
x
О
наличие несоответствия
ДНК комплементарна тандему олигонуклеидов
Рис. 1. Принципиальная схема колориметрической детекции анализируемого ДНК-фрагмента и выявления точковых мутаций.
В развитие этого метода, в данной работе показана возможность выявления тринуклеотидной делеции AF508 в гене CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) человека и исследован ряд факторов (длина анализируемого ДНК-фрагмента, лигирование двух- и трехкомпонентных тандемов), которые могут оказывать влияние на интенсивность колориметрического сигнала. Данная мутация является самой распространенной причиной, приводящей к муковисцидозу - наиболее часто встречающемуся моногенному наследственному заболеванию у представителей белой расы.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Использовали ДНК-лигазу фага Т4 (НИБХ СО РАН, Россия), конъюгат "стрептавидин-ще-лочная фосфатаза", любезно предоставленный М.Л. Филипенко (НИБХ СО РАН), хромогенные субстраты BCIP и NBT и N-гидроксисукцинимид-ный эфир биотина ("Molecular Probes", США), Твин-20 ("Fisher", США).
Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-700 ("Biosset", Россия) с использованием стандартных синтонов ("Glen Research", США) для фосфитами-дитного протокола [10]. Олигонуклеотиды и их производные выделяли с помощью ионообменной и высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии.
Концентрацию олигонуклеотидов определяли спектрофотометрически на приборе "Милихром 4" (Россия), используя суммарные величины мо-
лярных коэффициентов поглощения (£260) моно-и динуклеотидов на длине волны 260 нм [11].
Биотинилированные по 5'- или 3'- концевому фосфату дезоксирибонуклеотиды Bio-pAGGAAA-CA, Bio-pAAACACCA и pAGATGATATp-Bio, pAAGATGATATp-Bio синтезировали по методу, описанному ранее [12].
Электрофоретический анализ олигонуклеотидов проводили в денатурирующем (7 М мочевина) 20%-ном ПААГ (акриламид : К,№-метиленбиса-криламид, 29 : 1) в 50 мМ Трис-боратном буфере, рН 8.3, содержащем 0.1 мМ EDTA (TBE).
Меченые [5'-32Р]-олигонуклеотиды получали, используя [у-32Р]-АТР (НИБХ СО РАН) [13].
Геномную ДНК из крови больных и здоровых людей выделяли по описанному методу [14]. Кровь больных муковисцидозом предоставлена отделением пульмонологии МДКБСП № 3 г. Новосибирска.
ДНК-фрагменты 567(1463-2029) и 564 п.н. (дикий и мутантный типы) получали, используя поли-меразную цепную реакцию (ПЦР). ДНК-фрагменты длиной 91(1615-1705), 230(1625-1854), 392(1463-1854), 405(1625-2029) п.н. и 88, 227, 389 и 402 п.н. получали путем реамплификации ПЦР-фрагментов 567 и 564 п.н. соответственно. Использовали прай-меры: прямые - p1 = TGCCTGGCACCATTAAAG, p2 = GGAGGCAAGTGAATCCTG, p5 = = TTCCTGGATTATGCCTG и обратные - p3 = = GGGTAAGCTACTGTGAATGGAT, p4 = CAATG-GTTATTTATATGGCAGC, p6 = GCATGCTTTGAT-GACGC (рис. 1). Реакционная смесь (10-30 мкл) содержала 67 мМ Трис-НС1 (pH 8.9), 16 мМ
(NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 85 мкг/мл BSA, 0.01% Твин-20, 5 мМ ДТТ, 0.2 мМ dNTP (каждого), 2 мкМ праймеры, 1 мкг геномной ДНК или ~50 нг ПЦР-фрагмента 567 (564) п.н., 1.5 ед.акт. Taq-по-лимеразы. ПЦР проводили на амплификаторе "Mastercycler 5330 plus" ("Eppendorf", Германия). Продукты ПЦР анализировали и выделяли с помощью электрофореза в нативном 10%-ном ПААГ в буфере TBE. В качестве маркеров длины использовали ДНК-маркеры (М15) с длиной от 100 до 1000 п.н. ("Сибэнзим", Россия).
Нуклеотидную последовательность ПЦР-фраг-ментов определяли на автоматическом секвенато-ре ABI PRISM 310 Genetic Analyzer в центре коллективного пользования НИБХ и ИЦиГ СО РАН.
Лигирование. Реакционная проба включала 10-30 мкл раствора, содержащего олигонуклео-тиды (10-5 М), меченный биотином или 32Р олиго-нуклеотид (10-7 М), ДНК-матрицу (10-7 М), 25 ед.акт. ДНК-лигазы T4, 10 мМ MgCl2, 0.1 М NaCl, 10 мМ DTT, 1 мМ АТР, 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5). ПЦР-фрагмент предварительно денатурировали, прогревая его водный раствор при 100°С в течение 5 мин, и охлаждали во льду. Лигирование олигонуклеотидов проводили при 25°С в течение 15 мин.
Меченные 32P продукты лигирования анализировали с помощью электрофореза в денатурирующем 20%-ном ПААГ в буфере TBE. Гель ра-диоавтографировали на рентгеновскую пленку ("Primax", Германия), электрофореграмму сканировали с помощью программы "Gel-Pro Analyzer" ("Media Cybernetics", США), определяя интенсивность оптической плотности. Степень лигирования (в %) вычисляли как отношение радиоактивности участков геля, содержащих продукты лигирования, к суммарной радиоактивности в соответствующей дорожке.
Меченные биотином продукты лигирования
анализировали колориметрически после УФ-им-мобилизации. На поверхность капроновой мембраны ("Хийу калур", Эстония), помещенной на лист бумаги ("Whatman 3MM"), пропитанный 3 М NaCl, наносили в точку 3-7 мкл реакционной смеси. В качестве источника УФ-облучения использовали две ртутные лампы низкого давления ЭДБ-30, облучая с расстояния 17 см. Мембраны отмывали два раза по 10 мин буфером APT-7.5 (20 мM Трис-HCl, pH 7.5, 100 мM NaCl, 2 мM MgCl2, 0.5% Твин-20), выдерживали с раствором (60 мкл/см2) конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (1 мкг в 1 мл буфера AP-7.5, без Тви-на) в течение 30 мин при 22-25°С. Избыток конъюгата удаляли, трижды промывая буфером APT-7.5 по 5 мин. Перед нанесением хромоген-ных субстратов капрон промывали буфером AP-9.5 (того же состава, что и AP-7.5, но с pH 9.5) 5 мин. Раствор субстратов наносили из расчета
60 мкл на 1 см2 капрона (1 мл AP-9.5 + 4 мкл NBT + + 8 мкл BCIP). Растворы NBT и BCIP готовили из расчета: 75 мг/мл NBT в 70%-ном водном DMFA и BCIP 50 мг/мл в 50%-ном водном DMFA. Проявляли в течение 10-20 мин, затем промывали фильтр дистиллированной водой. Изображение мембран после проявления оцифровывали, используя сканер ("Mustek", Тайвань).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Схема колориметрического выявления мутаций в ДНК с пом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.