ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 5, с. 336-345
РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ
УДК 576.315.45
ВЫЯВЛЕНИЕ ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ В ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗАРОДЫШАХ И ООЦИТАХ МЫШИ
__w -t
С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ in situ1
© 2004 г. Ф. В. Коробова, Л. Г. Романова, Е. М. Нониашвили*, А. П. Дыбан*, О. В. Зацепина
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10 *Институт экспериментальной медицины РАМН 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12 Поступила в редакцию 19.09.03 г.
Окончательный вариант получен 16.12.03 г.
Описали локализацию рибосомной ДНК в одноклеточных зародышах и ооцитах мыши на стадии второго деления созревания с помощью флуоресцентной гибридизации in situ с использованием меченых проб к различным участкам рибосомного повтора мыши. Показали, что в пронуклеусах ри-босомные гены образуют компактные кластеры, число которых не превышает числа ядрышкооб-разующих районов хромосом. В подавляющем большинстве пронуклеусов не все предшественники ядрышка (nucleolar precursor bodies) ассоциированы с рибосомной ДНК, а часть рибосомных повторов располагается в нуклеоплазме вне видимой связи с предшественниками ядрышка. В совокупности эти наблюдения говорят о том, что пространственная ассоциация рибосомных генов с предшественниками ядрышка не является строго обязательной. Высказано предположение о том, что взаимодействие рибосомных генов с предшественниками ядрышка опосредовано центромерным гетерохроматином. В линиях мышей СВА и C57BL число ядрышкообразующих хромосом различается, а рибосомные гены неравномерно распределяются между индивидуальными ядрышкообразу-ющими хромосомами и в некоторых случаях - между ядрышкообразующими районами сестринских хроматид.
Ключевые слова: ядрышкообразующие районы хромосом, гены рибосомной РНК, зародыши, ооци-ты, мышь, флуоресцентная гибридизация in situ.
Раннее эмбриональное развитие всех млекопитающих начинается с периода, когда геном зародыша находится в транскрипционно инертном состоянии, а рост зародыша осуществляется за счет транскриптов РНК и белков материнского происхождения. Продолжительность этого периода варьирует у разных видов млекопитающих и, по-видимому, является наиболее короткой у зародышей мыши (Дыбан, 1988). У всех изученных на сегодняшний день видов гены, контролируемые РНК-полимеразой II, начинают транскрибироваться раньше генов, находящихся под контролем РНК-полимеразы I и кодирующих рибосомную РНК (рибосомные гены, рДнК). Установлено, что у лабораторной мыши Mus musculus гены структурных белков активируются в конце первого клеточного цикла, тогда как рибосомные гены начинают транскрибироваться в середине второго клеточного цикла, примерно через 44-45 ч после введения хорионического гонадотропина (ХГ) (Bouniol et al., 1995; Zatsepina et al., 2003).
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 01-04-49810, 02-04-49373).
С этого момента в зародышах начинается формирование типичного ядрышкового аппарата. В его составе появляются белки, необходимые не только для транскрипции рДНК (UBF, РНК-полиме-раза I, топоизомераза II), но и для созревания рибосом (например, В23/нуклеофозмин) (Biggiogera et al., 1994; Baran et al., 1995; Ferreira, Carmo-Fonse-ca, 1995; Baran et al., 2001; Zatsepina et al., 2003). На стадии 4-8-клеточного зародыша ядрышки приобретают все структурные элементы активных (зрелых) ядрышек соматических клеток, включая фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент и гранулярную часть (Fakan, Odartchenko, 1980; Dyban et al., 1990). Таким образом, формирование типичного ядрышкового аппарата в зародышах мыши занимает три-четыре клеточных цикла.
Согласно существующим представлениям, образование зрелого ядрышка в зародышах млекопитающих, включая мышь, происходит с участием структур, которые получили название "nucleolar precursor bodies" (Flechon, Kopechny, 1998). В русской транскрипции эти структуры могут
быть обозначены как проядрышки (Дыбан, 1988) или предшественники ядрышка, ПЯк (Коробова и др., 2003). ПЯк представляют собой округлые, оптические плотные структуры размером от 1 до 5 мм, число которых на ядро варьирует от 1 до 10. Они формируются в пронуклеусах одноклеточного зародыша сразу после оплодотворения или искусственной активации яйцеклетки (Dyban et al., 1990). При вступлении зародышей в митоз ПЯк разрушаются, но затем вновь образуются в ядрах после завершения первого деления дробления и вступления зародыша во второй клеточный цикл. На ультраструктурном уровне ПЯк одноклеточных зародышей образованы скоплениями однородного фибриллярного материала и, согласно общепринятым представлениям, не различаются по своей морфологии (Flechon, Kopechny, 1998). Природа материала, образующего ПЯк, изучена крайне плохо, поскольку до сих пор ПЯк не удалось получить в виде биохимической фракции. Методами цито- и иммуноцитохимии помимо ДНК на поверхности ПЯк выявляются РНК, ар-гентофильные белки и основной белок зрелых ядрышек фибрилларин, которые, вероятно, переносятся в оплодотворенную или искусственно активированную яйцеклетку в составе цитоплазмы ооцита (Dyban et al., 1990; Biggiogera et al., 1994; Zatsepina et al., 2003). Неизвестны также молекулярные механизмы, регулирующие формирование ПЯк и ответственные за транспорт их компонентов из цитоплазмы в ядро. Принято считать, что основной ролью ПЯк является участие в пространственной организации и сборке активного ядрышкового аппарата. В пользу этих представлений говорит, в частности, то, что активная рДНК и другие молекулярные компоненты зрелых ядрышек выявляются на поверхности ПЯк (Prather et al., 1990; Baran et al., 1995; Ferreira, Car-mo-Fonseca, 1995; Baran et al., 2001; Zatsepina et al., 2003). Однако в целом функциональное значение ПЯк в зародышах млекопитающих на сегодняшний день не выяснено. Для подавляющего большинства видов млекопитающих, кроме свиньи (Viuff et al., 2002), отсутствуют сведения о локализации рДНК в зародышах, не синтезирующих рРНК.
В настоящей работе мы изучили локализацию ядрышкообразующих (ЯО) районов (ЯОР) хромосом в одноклеточных зародышах мыши, рДНК которых находятся в транскрипционно инертном состоянии (Engel et al., 1977; Hamsmann et al., 1978; Паткин, Сорокин, 1983; Dyban et al., 1990; Bouniol et al., 1995). Для этих целей был использован метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с пробами рДНК мыши, который позволил локализовать рДНК с высоким разрешением и специфичностью. Особое внимание при анализе препаратов уделяли пространственному взаимодействию рДНК с ПЯк. Для контроля качества
реакции использовали метафазные хромосомы одноклеточных зародышей и мейотические хромосомы овулировавших ооцитов, находящихся в метафа-зе второго деления созревания (MII-ооциты).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объекты исследования. Работа выполнена на зародышах мышей-гибридов FXCBA х C57BL из питомника РАМН "Рапполово" Ленинградск. обл. Зародыши получали при гормональной стимуляции (суперовуляции) самок и вымывали из яйцеводов средой М2 и НТ6 по стандартной методике (Зацепина и др., 1987). Зародыши на стадии метафазы первого делении дробления получали после инкубирования оплодотворенных яйцеклеток 2-3 ч в среде М16 с колцемидом (0.04 мкг/мл) или нокадазолом (0.1 мкг/мл). Ооциты, полученные от мышей линии C57BL, на стадии метафазы второго деления созревания выделяли из ампулы яйцевода через 14 ч после введения ХГ. Ооциты освобождали от кумулусных клеток путем обработки гиалуронидазой (1 мкг/мл) в течение 2 мин. Для проведения реакции гибридизации in situ использовали препараты зародышей и ооцитов, приготовленные по методу, подробно описанному ранее (Dyban, 1983, 19991), с небольшими модификациями. Под контролем стереомикроскопа МБС8 (Россия) при помощи микропипетки зародыши или ооциты помещали на 5-10 мин в чашку Петри (диаметром 35 мм) с гипотоничным раствором, содержащим 1.93%-ный раствор цитрата натрия и 0.56%-ный раствор хлорида калия (в соотношении 1 : 3). Затем для фиксации их переносили на 20-30 с в солонку с охлажденной до -10°С смесью абсолютного метанола и абсолютной ледяной уксусной кислоты (3 : 1). После этого зародыши и ооциты переносили вместе с каплей фиксатора на предметное стекло и капали на них сначала размягчающую смесь 1 (1 часть абсолютного метанола и 1 часть 75%-ной уксусной кислоты), а затем размягчающую смесь 2 (1 часть абсолютного метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты). Зародыши и ооциты оставляли на предметном стекле до полного высыхания размягчающей смеси 2. После этого на стекло наносили несколько капель стандартного фиксатора (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты, 3 : 1) и высушивали препараты при комнатной температуре.
Пробы, использованные в экспериментах по гибридизации in situ. В работе использовали три зонда к рДНК мыши (рис. 1). Проба 1 (EcoRI-EcoRI фрагмент рДНК размером 11.35 т.п.о., от -5.715 до +5.635) выявляла часть межгенного не-транскрибируемого спейсера (НТС), 5'-внешний транскрибируемый спейсер (5'ВшТС) и большую часть фрагмента 18S рДНК. Проба 2 (EcoRI-EcoRI фрагмент рДНК размером 6.6 т.п.о., от
НТС 5'ВшТС
ВнТС1 ВнТС2
EcoRI I_
Проба 1 11.35 т.п.о.
EcoRI _I
Проба 2 6.6 т.п.о.
3'ВшТС
EcoRI I_
НТС
Проба 3 4.3 т.п.о.
EcoRI _I
Рис. 1. Схематичное изображение карты рибосомного повтора мыши и проб рДНК, использованных для гибридизации in situ.
НТС - межгенный нетранскрибируемый спейсер; 5'ВшТС - 5'-внешний транскрибирумый спейсер; ВнТС1, ВнТС2 -первый и второй внутренние транскрибируемые спейсеры соответственно; 3'ВшТС - 3'-внешний транскрибируемый спейсер, EcoRI - сайты рестрикции EcoRI.
+5.635 до +12.235) выявляла оставшуюся часть последовательности 18S рДНК, первый внутренний транскрибируемый спейсер (ВнТС1), 5.8S рДНК, второй внутренний транскрибируемый спейсер (ВнТС2) и ~80% последовательности 28S рДНК. Проба 3 (EcoRI-EcoRI фрагмент рДНК размером 4.3 т.п.о., от +12.235 до +16.535) выявляла оставшуюся часть 28S рДНК и 3'-внешний транскрибируемый спейсер (3'ВшТС). Плазмид-ные конструкции pMr974,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.