НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 3, с. 234-242
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 612.821
ВЫЗВАННАЯ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИЕЙ МОДИФИКАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ТИОРЕДОКСИНОВ И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗ В ГИППОКАМПЕ КРЫС СОХРАНЯЕТСЯ ПО ДОСТИЖЕНИИ ИМИ
ВЗРОСЛОГО СОСТОЯНИЯ © 2015 г. С. А. Строев1, 2, *, Е. И. Тюлькова2, Л. А. Ватаева2, М. Т. Миеттинен1
1Отдел Анатомии, Школа Медицины, Университет г. Тампере, и Отдел Патологии, Университетский Госпиталь г. Тампере, Тампере, Финляндия 2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия
Пренатальная гипоксия вызывает структурные и функциональные нарушения в мозге, проявляющиеся в процессе последующего постнатального онтогенеза. Некоторые когнитивные и поведенческие нарушения, вызванные пренатальной гипоксией, сохраняются даже во взрослом состоянии. Окислительный стресс является ключевым фактором повреждения при гипоксии. Соответственно соотношение про- и антиоксидантных систем играет важную роль в развитии как патологических, так и адаптивных процессов, вызываемых гипоксией. В настоящей работе методом иммуноцитохи-мии была исследована экспрессия четырех эндогенных белковых антиоксидантов (Си, /п-суперок-сиддисмутазы, Мп-супероксиддисмутазы, тиоредоксина-1 и тиоредоксина-2) в нейронах гиппо-кампа взрослых крыс, ранее перенесших трехкратную гипоксию на 14, 15 и 16-е сут своего прена-тального развития. Было показано, что в ряде случаев пренатальная гипоксия существенно модифицирует экспрессию эндогенных антиоксидантов в нейронах гиппокампа крыс, достигших взрослого возраста (80-90-е сут постнатального онтогенеза). Направленность этих изменений, однако, различна для разных антиоксидантов и областей гиппокампа. По-видимому, эта разнонаправ-ленность изменений экспрессии различных антиоксидантов в разных областях отражает неразрывную взаимосвязь между патологическими последствиями пренатальной гипоксии и вызванными ею же процессами адаптации.
Ключевые слова: пренатальная гипоксия, онтогенез, антиоксиданты, тиоредоксин, супероксиддисмутазы.
DOI: 10.7868/S1027813315030103
ВВЕДЕНИЕ
Проблема пренатальной гипоксии и ее отдаленных последствий чрезвычайно актуальна с точки зрения исследования механизмов развития различных патологических состояний в ходе онтогенеза [1, 2]. Современные исследования показали развитие патологических изменений функциональных показателей головного мозга в ходе последующего постнатального онтогенеза в ответ на воздействие тяжелой гипоксии и других экстремальных факторов в пренатальном периоде [3—10]. В то же время изменения, вызванные пре-натальной гипоксией, в некоторых случаях могут
*Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; e-mail: s_stroev@hotmail.com. Принятые сокращения: Cu, Zn-СОД — Cu, Zn-зависимая су-пероксиддисмутаза, Mn-СОД — Mn-зависимая супероксид-дисмутаза, Trx-1 — тиоредоксин-1, Trx-2 — тиоредоксин-2, CA — cornu Ammonis (Аммонов рог), DG — dentate gyrus (зубчатая извилина), АФК — активные формы кислорода.
носить не только патологический, но и адаптивный характер. На такую мысль, в частности, наводят результаты поведенческих экспериментов [3—5, 8—9]. Гипоксия играет важную роль в генезисе нарушений развития организма [11—13]. Она является одной из наиболее частых причин гибели плода в антенатальном периоде, а также во многом определяет частоту психических и физических заболеваний в постнатальном онтогенезе [14, 15].
Пренатальная гипоксия может вызывать сложный комплекс нарушений в структуре и функции мозга плода. Считается, что одним из ведущих факторов при этом является повреждение нейронов. Предполагается также, что гипоксия, действуя на нейроны во внутриутробном периоде, приводит к формированию в этих клетках стойких изменений, сохраняющихся и после рождения. Кроме того, гипоксия, воздействуя на головной мозг плода, может влиять не только на
нейроны, но вызывать стойкие изменения и во вспомогательных клетках — глиоцитах. Гипокси-ческая экспозиция приводит к развитию ацидоза и окислительного стресса, а также к повышению активности возбуждающей глутаматергической системы. Кроме того, наблюдается активация эндогенных фосфолипаз и распад мембранных фос-фолипидов, увеличение текучести мембран и их проницаемости, вследствие чего клетка теряет ионы К+ и подвергается перегрузке ионами №+ и Са2+ [15-17].
Особую роль в повреждении нейронов мозга при гипоксии играет окислительный стресс, связанный с гиперпродукцией активных форм кислорода (АФК) [18, 19]. Повышенная уязвимость для окислительного стресса незрелого мозга по сравнению со зрелым объясняется двумя причинами: во-первых, для незрелого мозга характерна низкая активность систем антиоксидантной защиты, а, во-вторых, в нем отмечается высокое содержание свободных ионов железа. Антиокси-дантная защита клеток обеспечивается различными неферментативными и ферментативными факторами, включая тиоредоксины (Тгаз) и су-пероксиддисмутазы (СОД), которые представлены как цитозольными (Си, Zn-СОД, Тгх-1), так и митохондриальными (Мп-СОД, Тгх-2) формами. Повышение уровня перекиси водорода (Н202) в незрелом мозге оказывает значительно больший разрушающий эффект вследствие более высокого по сравнению со зрелым мозгом содержания свободных ионов железа, и, соответственно, интенсификации протекания реакции Фентона — химической реакции неферментативного образования из перекиси водорода высокореакционных гидроксильных радикалов.
Непосредственное воздействие кислородной недостаточности и гиперпродукции свободных радикалов является важным, но, возможно, не единственным фактором повреждения клеток мозга во время и после тяжелой гипоксии. Другим важным фактором повреждения может быть нарушение баланса гормонов и нейромедиаторов, взаимодействующих с клеточными рецепторами, в том числе повышенный уровень гормонов стресса в крови плода, который, в свою очередь, может быть следствием стрессорных реакций материнского организма. Соотношение этих двух одновременно действующих механизмов повреждения остается дискуссионным и для взрослого, и в особенности для эмбрионального мозга, поскольку в метаболизме последнего анаэробные процессы играют заметно более значимую роль, чем в метаболизме зрелого мозга [20].
Эффект гипоксии существенно зависит от конкретных сроков пренатального развития, на которых она была перенесена [3, 4, 10, 21, 22]. В ряде ранее опубликованных работ было показа-
но, что гипоксия, перенесенная на 14—16-е сут (но в гораздо меньшей степени гипоксия, перенесенная на 17-19-е сут) пренатального развития, приводит к нарушениям сигнальной трансдукции и, как следствие, к долговременным изменениям ряда поведенческих характеристик и способности к обучению [3-5, 8-10, 23, 24].
Задачей настоящей работы было исследование отдаленных последствий тяжелой гипоксии, перенесенной на 14-16-е сут пренатального развития, на экспрессию антиоксидантных белков (тиоре-доксинов и супероксиддисмутаз) в нейронах гип-покампа крыс, достигших взрослого возраста.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Беременные самки крыс линии Вистар, выращенные в виварии Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, подвергались воздействию тяжелой гипобарической гипоксии трехкратно по 3 ч в день на 14, 15 и 16-е сут беременности при давлении 180 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 11000 м или снижению содержания кислорода до 5% при нормобариче-ской гипоксии. Воздействие гипобарической гипоксии осуществлялось в барокамере проточного типа при температуре 20-25°С [25] в соответствии со стандартным протоколом [26, 27].
Высота 11000 м была выбрана как критическая, поскольку в ранее проводившихся экспериментах смертность взрослых крыс-самцов за 3 ч пребывания в барокамере составляла 50% [28]. Смертность беременных самок была значительно ниже и составляла в среднем около 15%.
Крысы, перенесшие гипоксию на 14-16-е сут своего пренатального развития, исследовались на 80-90-е сут их постнатальной жизни, т.е. по достижении ими взрослого состояния. Исследование проводилось на четырех животных, переживших пренатальную гипоксию и четырех контрольных животных того же возраста. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями, сформулированными в Директивах Совета Европейской Комиссии (89/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований и с Директивой Евросоюза 2010/63/EU для экспериментов над животными. Протоколы опытов были утверждены комиссией по гуманному обращению с животными ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН.
Последовательность перфузии и декапитации животных, а также фиксации и хранения полученных образцов мозга была детально описана в ранее опубликованных работах [26]. С целью более полной криопротекции образцы мозга в течение двух суток непосредственно перед началом анализа выдерживали в смеси (1 : 1) 20% сахарозы в PBS и Tissue-Tek. Затем образцы замораживали
в Tissue-Tek® O.C.T™ Compound (Sakura Finetek Europe B.V.) и немедленно с помощью криоката при температуре —20° C делали фронтальные срезы мозга толщиной 11 мкм на уровне гиппокампа и базо-латеральной миндалины, т.е. примерно — 2.80 мм от линии bregma [29].
Уровень экспрессии антиоксидантов определяли в структурах гиппокампа путем иммуноци-тохимического анализа, проводимого стандартным авидин-биотиновым методом. Срезы помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (Sigma) и в течение 15 мин преинкуби-ровали в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Boehringer Mannheim GmbH). Затем в течение ночи каждую из четырех групп срезов инкубировали с одним из первичных по-ликлональных аффинно-очищенных кроличьих антител (разведенных в фосфатном буфере PBS, содержащем 1% BSA и 0.3% Triton X-100) при +4° С) к соответствующему антиоксидантному белку: 1) к цитозольному тиоредоксину-1 мыши (антитела любезно предоставили доктор Юмика Нишинака и профессор Юнджи Ёдой, Отдел биологических ответов Института исследования вирусов при Университете г. Киото, Япония; разведение 1 : 500) [30], к митохондриальному тиоре-доксину-2 крысы (антитела любезн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.