БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 1, с. 79-86
УДК 612.8113
ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ СТРУКТУР ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ ДЕПО В ФОРМИРОВАНИИ КАЛЬЦИЕВЫХ СИГНАЛОВ В ПЕРВИЧНЫХ СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНАХ
© 2007 г. И. В. Степанова, Е. П. Костшк, П. Г. Костшк
Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, ул. Богомольца, 4, Киев 01601 Украина; тел./факс: +38 (044) 253-64-58; электронная почта: pkostyuk@biph.kiev.ua
Поступила в редакцию 17.04.2006 г .
Методом двухволновой микрофлуориметрии исследовано взаимное участие различных кальций-ре-гулирующих механизмов в формировании внутриклеточных кальциевых сигналов в первичных сенсорных нейронах крыс. Показано, что наиболее мощным внутриклеточным механизмом, участвующим в кальциевом обмене у исследованных нейронов, являются митохондрии. Эти органеллы участвуют в модуляции кальциевых сигналов, вызванных как входом Са2+ из внеклеточной среды, так и высвобождением ионов из депо эндоплазматического ретикулума (ЭР). Анализ кальциевого обмена при разных источниках повышения концентрации Са в цитозоле показал достоверные различия в эффективности обмена ионов, поступающих в цитозоль из внеклеточной среды и ионов, высвобождающихся из депо ЭР. Опустошение ЭР при активации рианодин-чувствительных или инозитолтрифосфат- (1шР3-) чувствительных рецепторов, а также при блокировании обратного захвата Са2+ из цитозоля путем ингибирования АТР-аз, приводило к возникновению депо-активируе-мого входа Са2+ из внеклеточной среды в цитозоль нейронов. Кинетические характеристики фазы нарастания таких депо-активируемых кальциевых сигналов зависели от способа опустошения ЭР, что позволило выдвинуть предположение о различиях в механизмах активации исследованных сигналов. Блокирование унипортера митохондрий на фоне активации депо-зависимых кальциевых сигналов приводило к ускорению возврата внутриклеточной концентрации Са2+ до первоначального базового уровня. По-видимому, этот феномен связан с ускоренной инактивацией депо-активируе-мых кальциевых сигналов при угнетении захвата Са2+ митохондриями.
Повышение концентрации свободных ионов кальция в цитозоле является универсальным сигналом, регулирующим широкий спектр клеточных функций [1, 2]. Существует два основных пути повышения концентрации Са2+ в цитозоле клетки. Первый путь связан со входом ионов Са2+ из внеклеточной среды, а второй - с высвобождением этих ионов из внутриклеточных кальциевых депо. В нервных клетках вход Са2+ из внеклеточной среды сопровождается активацией потенциал-управ-ляемых [3] и/или рецептор-управляемых [4] ионных каналов плазматической мембраны, проницаемых для Са2+. На сегодняшний день получены данные о биофизических свойствах этих белков и их стехиометрии, а также идентифицированы аминокислоты, играющие ключевую роль в селективности этих каналов [5]. Большое внимание уделяется и участию в кальциевом гомеостазе внутриклеточных кальций-регулирующих механизмов -митохондрий и эндоплазматического ретикулума (ЭР) [6, 7]. Результаты работ Б.И. Ходорова и его сотрудников свидетельствуют о чрезвычайной важности этих органелл в формировании внутриклеточных кальциевых сигналов, вызванных стимуляцией клетки [8, 9]. В нашей работе предприня-
та попытка проанализировать взаимный вклад митохондрий и ЭР в формирование внутриклеточных кальциевых сигналов, а также выявить возможную связь между степенью заполненности ЭР ионами Са2+ и активацией дополнительного входа Са2+ из внеклеточной среды в цитозоль в первичных ноци-цептивных сенсорных нейронах крыс. Такой вход Са2+ в цитозоль нейронов, вызванный опустошением внутриклеточных кальциевых депо (так называемый депо-управляемый вход Са2+), долгое время считался механизмом, необходимым для обеспечения повышения концентрации внутриклеточного Са2+ исключительно в невозбудимых клетках. Однако исследования спонтанного восстановления запаса Са2+ в рианодин-чувствительном депо ЭР при потенциале покоя в симпатических [10] и сенсорных нейронах [11], а также в нейронах гиппокампа [12], показали существование в этих клетках альтернативного механизма поступления ионов Са2+ в цитозоль. Еще одним доказательством существования такого пути входа Са2+ из внеклеточной среды послужили работы по изучению чувствительности базальной концентрации внутриклеточного Са2+ к внеклеточной концентрации этого иона [13].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение изолированных нейронов спиналь-ных ганглиев (СГ). Для получения отдельных клеток СГ использовали стандартную процедуру ферментативной изоляции [14]. Крыс (возраст 21 день) декапитировали под легким эфирным наркозом, после чего выделяли СГ грудных и поясничных сегментов и помещали их на 15-20 мин в охлажденный до 4°С раствор Тироде (состав растворов приведен ниже). После отмывания ганглии переносили в пробирку, содержащую 2.5 мл подогретого до 36°С раствора Тироде с добавлением 2 мг/мл коллагеназы (тип IA, "Sigma", США) и 1 мг/мл протеазы (тип XIV, "Sigma"), где их инкубировали при постоянной температуре в течение 30 мин. После ферментативной обработки ганглии отмывали в течение 20 мин раствором Тироде той же температуры, не содержащим ферментов. Для получения клеточной суспензии ганглии, помещенные в 0.5 мл раствора Тироде, пропускали через стеклянные оплавленные пастеровские пипетки в течение 5 мин. Полученную суспензию переносили в пластиковые чашки Петри ("Nunc", Дания) и выдерживали в термостате при 36°С в течение 1 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток ко дну чашек. Клетки использовали в эксперименте в течение 68 ч после выделения.
Нейроны для эксперимента отбирали в два этапа. На первом этапе основным критерием отбора был размер сомы нейронов (18-24 мкм). Функциональным маркером ноцицептивных нейронов является наличие в плазматической мембране этих клеток так называемых ваниллоидных рецепторов - ионных каналов семейства TRP (transient receptor potential), проницаемых для ионов Ca2+. Для экспериментов отбирали нейроны малого диаметра, в которых короткая аппликация внеклеточного раствора, содержащего 100 нМ капсаицин (аго-ниста ваниллоидных рецепторов), вызывала повышение внутриклеточной концентрации Ca2+.
Микрофлуориметрическое определение внутриклеточной концентрации Са2+. После прикрепления нейроны загружали флуоресцентным красителем indo1-/AM ("Molecular Probes Inc.", США). С этой целью к 1 мл раствора Тироде добавляли 10 мкл маточного раствора indo-1/АМ и 10 мкл 25% раствора плюроновой кислоты (Pluronic-127) в DMSO ("Molecular Probes Inc.", США). В этом растворе клетки выдерживали в течение 30 мин, после чего их отмывали обычным раствором Тироде. Для проведения измерений чашки Петри с загруженными красителем клетками помещали в экспериментальную камеру, установленную на станине инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного водоиммерсионным объективом (х40), и постоянно перфузировали раствором Тироде. Запись кальциевых сигналов (изменений внутриклеточной концентрации Ca2+, [Ca2+]i) осуществ-
ляли с помощью программного обеспечения Тида (Tida Software, "Batelle", Германия). Значения [Ca2+]j вычисляли с помощью уравнения Гринкеви-ча [15].
Растворы и реактивы. Базовым внеклеточным раствором, который использовали для перфузии экспериментальной камеры и приготовления всех других внеклеточных растворов, был модифицированный раствор Тироде следующего состава (в мМ): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl2 - 2, CaCl2 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10, рН 7.35. Для деполяризации мембраны нейронов использовали раствор с повышенным содержанием калия (состав в мМ: NaCl - 92, KCl - 50, MgCl2 - 2, CaCl2 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10).
Все численные значения результатов исследований приведены в виде средних значений и ошибки среднего. После каждого значения указано число экспериментов (n), которое практически совпадает с числом исследованных клеток. Достоверность статистических различий среднегрупповых значений определяли с помощью ¿-критерия Стьюдента при уровне достоверности p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Среднее значение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция в ноцицептивных нейронах спинальных ганглиев 3-недельных крыс составило 118 ± 9 нМ (n = 40). Деполяризация плазматической мембраны раствором с высоким содержанием калия в течение 3 с вызывала кальциевый ответ, или сигнал - временное повышение [Ca2+]i. Этот кальциевый сигнал имел фазу быстрого нарастания продолжительностью 3 с и фазу спада со сложной кинетикой. В течение первых 8 с фазы спада происходило быстрое снижение концентрации ионов кальция до некоторого значения, которое затем сохранялось в течение 3-4 мин, образуя вторую фазу спада, так называемую фазу плато. Восстановление концентрации кальция до базового уровня практически всегда происходило через 4-5 мин. Пиковые значения кальциевых сигналов, характеризующие вход кальция в клетку через потенциал-управляемые кальциевые каналы, составляли в среднем 377 ± 21 нМ, в то время как кривая их спада описывала кинетику выведения Ca2+ из цитозоля. Повторная аппликация деполяризующего раствора после восстановления внутриклеточного уровня Ca2+ до первоначальной базовой концентрации, вызывала кальциевый ответ, аналогичный по кинетике и достоверно не отличающийся по амплитуде от предыдущего кальциевого сигнала.
Для оценки участия ЭР в формировании временных изменений концентрации Ca2+ в цитозоле деполяризацию плазматической мембраны осуществляли после предварительной аппликации
[Са]р нМ
500 г
400-
300-
200-
100- ^
0 100 200 300 400 500 600 700 с
[Са]р нМ 600
500
400
300
200
100
0 100 200 300 400 500 600 700
Рис. 1. Кальциевые сигналы, вызванные деполяризацией плазмалеммы (Т) в контрольных условиях и после опустошения эндоплазматического ретикулума, вызванного предварительной аппликацией блокатора кальциевых АТР-аз ЭР тапсигаргина (□). По оси абсцисс - время (с); по оси ординат - внутриклеточная концентрация Са2+ (нМ).
Рис. 2. Кальциевые сигналы, вызванные деполяризацией плазматической мембраны (Т) в контрольных условиях и при заблокированной митохондриальным протонофором С1ССР кальций-обменной функции митохондрий (□). По оси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.