МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 712-718
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.152.313
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ SeeB И SeeA С N-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТЬЮ ЗРЕЛОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli ПРИ ЕЕ СЕКРЕЦИИ
© 2003 г. О. В. Хохлова1, М. А. Несмеянова*
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук,
142290, Московская обл., Пущино 1Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл. 142290 Поступила в редакцию 29.10.2002 г.
Цитоплазматическая стадия секреции белков, которые используют Sec-зависимый секреторный путь, катализируется у Escherichia coli экспорт-специфическим шапероном - белком SecB, и транслокационной АТРазой - белком SecA. Показано, что влияние этих белков на эффективность секреции периплазматической щелочной фосфатазы E. coli зависит от первичной структуры N-конце-вой области зрелой части предшественника этого белка. Замены аминокислотных остатков вблизи сигнального пептида (положение +2, +3), существенно подавляющие секрецию, снижают и ее зависимость от присутствия в клетках SecB и активности SecA. С использованием коиммунопреципита-ции выявлено снижение взаимодействия этих белков с предшественником щелочной фосфатазы, несущим мутации в этой области, что указывает на взаимодействие SecB и SecA с зрелой частью пребелка вблизи сигнального пептида.
Ключевые слова: Escherichia coli, щелочная фосфатаза, транслокация белка, SecB, SecA.
Многие белки Escherichia coli, синтезируемые в цитоплазме, становятся функционально активными только после транслокации через цито-плазматическую мембрану в специфические ком-партменты клеточной оболочки, периплазму и внешнюю мембрану. Для правильной транслокации этих белков необходимы компоненты секреторного аппарата, а также сигналы направления к мембране (таргетинг) в самом секретируемом белке [1, 2]. Эти сигналы необходимы для узнавания белка секреторным аппаратом и транслокации его через мембрану. Они локализованы, прежде всего, в дополнительной N-концевой части полипептидной цепи предшественника секре-тируемого белка, так называемом сигнальном пептиде [3], который отщепляется после транслокации белка, а также в доменах зрелой полипептидной цепи [4]. Один из таких доменов недавно обнаружен нами в N-концевой области зрелой щелочной фосфатазы (PhoA) E. coli [5, 6]. Замены аминокислотных остатков в этой области, особенно вблизи участка отщепления сигнального пептида, приводили к существенному подавлению секреции, как предполагается, за счет нарушения взаимодействия предшественника (преР^А) с компонентами секреторной системы.
Принятые сокращения. PhoA - зрелая форма щелочной фосфатазы Escherichia coli, преPhoA - предшественник щелочной фосфатазы.
* Эл. почта: aniram@ibpm.serpukhov.su
Секреторная система E. coli включает [2, 7] ци-топлазматический шаперон SecB, комплекс Fth-4.5 S РНК (сигнал-узнающая частица E. coli), транслокационную АТРазу SecA и мембранный транслокон, состоящий из интегральных мембранных белков - гетеротримера SecYEG, а также белков SecD, SecF и YajC. В Sec-зависимом секреторном пути E. coli экспорт-специфическим шапероном является белок SecB [8]. Это гомотетра-мерный белок, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 17 кДа [2]. В клетке он выполняет, по крайней мере, две функции. Одна состоит в том, что он узнает зрелую часть вновь синтезируемого предшественника секретируемого белка (пребелка), препятствуя его преждевременному и неправильному сворачиванию и сохраняя его структуру в компетентном для транслокации состоянии [8, 9]. Другая функция SecB - направлять пребелок к мембране, в частности, к связанному с транслоконом белку SecA [10]. SecB, кроме того, увеличивает АТРазную активность SecA [11].
Белок SecA - наиболее важный компонент секреторного аппарата, функционирует в комплексе с гетеротримером SecYEG как транслоказа [2, 7]. SecA функционирует в виде гомодимера, каждый мономер которого содержит два домена: С-концевой (34 кДа) и N-концевой (68 кДа) [12]. Последний ответствен за связывание и гидролиз АТР, а С-концевой - за связывание с комплексом SecB-предшественник [13] и анионными фосфо-липидами мембран [14]. В настоящее время по-
дробно описана модель SecB-зависимого направления пребелков к мембранной SecA-SecYEG-транслоказе, а новые данные о структурной организации SecB позволяют понять некоторые принципы межмолекулярных взаимодействий между этими компонентами секреторной машины и сек-ретируемыми белками [13]. Однако основы такого взаимодействия выяснены не полностью и требуют решения. Это касается и специфичности участков взаимодействия SecB и SecA с предшественниками секретируемых белков при инициации секреции.
B нашей предыдущей работе впервые установлена зависимость секреции PhoA, ранее считавшейся SecB-независимой [15], от присутствия в клетках этого экспорт-специфического шаперо-на [16], но только при 30°С. Это подтверждает оригинальную модель [17], согласно которой SecB-зависимость секреции определяется скоростью сворачивания белка. Результаты изучения секреции мутантных PhoA с заменами аминокислотных остатков в экспорт-инициирующем домене позволили предположить, что SecB взаимодействует с этим доменом вблизи сигнального пептида [6]. Цель настоящей работы - более детально изучить взаимодействие белков SecB и SecA с N-концевой областью зрелой части преPhoA. Показано, что влияние SecB и SecA на секрецию зависит от первичной структуры этой области, а с помощью метода коиммунопреципитации белков установлено снижение связывания SecB и SecA с мутантным преPhoA, что указывает на взаимодействие этих белков с N-концевой областью зрелой PhoA при ее трансляции.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и плазмиды. B работе использовали штамм E. coli MC4100 [18] и производный от него CK1953 [19]. Оба штамма трансформированы плазмидами pSAP10, pSAP12 и pSAP14, содержащими природный и мутантные гены phoA соответственно, под контролем промотора PBAD ara [20]. Мутантные гены кодировали PhoA с заменами аминокислотных остатков в положениях +2, +3 и +13, +14 на два остатка Lys.
Среда и условия культивирования. Клетки культивировали при 30°С до середины логарифмической фазы роста на минеральной среде [21] с добавлением 0.07% пептона, 0.5% глицерина вместо глюкозы в качестве источника углерода [22] и 1 мМ ортофосфата. Для поддержания плазмиды pSAP использовали ампициллин (100 мкг/мл). Синтез PhoA индуцировали добавлением 0.5% араби-нозы, и клетки инкубировали 60 мин. Для остановки биосинтетических процессов использовали мертиолят в конечной концентрации 0.02%.
Секреция PhoA. Эффективность секреции природной и мутантных PhoA оценивали с помо-
щью двух подходов. Первый включал анализ ферментативной активности PhoA в культуре клеток-продуцентов, так как известно, что PhoA становится активной только после транслокации через мембрану в периплазму, где происходит формирование активной молекулы за счет образования дисульфидных связей и димеризации субъединиц [23]. Другой подход включал анализ динамики превращения импульсно меченного преР^А в зрелый белок (созревание) [24], так как этот процесс, связанный с отщеплением сигнального пептида, также происходит после транслокации белка через мембрану.
Получение бесклеточного экстракта. Сферо-пласты E. coli получали по методу Миуры и Ми-цушимы [25] с помощью лизоцима и EDTA в присутствии сахарозы, осаждали центрифугированием при 15000g в течение 15 мин и лизировали в условиях осмотического шока в 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5, с использованием гомогенизатора. Для экстракции белков цитоплазматической мембраны лизат сферопластов обрабатывали раствором 2%-ного (м/о) тритона Х-100, 10 мМ MgCl2, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.6 [26]. Обломки мембран удаляли центрифугированием при 6000g в течение 15 мин.
Коиммунопреципитация PhoA, SecB и SecA. Им-
мунопреципитацию преР^А и PhoA проводили, как описано ранее [24 ]. В иммунопреципитате с помощью иммуноблотинга с соответствующими антителами определяли присутствие белков SecB и SecA. Соотношение PhoA: SecB и PhoA: SecA рассчитывали с помощью программы Kodak Digital Scienсe 1D.
Аналитические методы. Активность PhoA определяли по скорости гидролиза n-нитрофенил-фосфата, принимая за единицу активности (Е) количество фермента, гидролизующего 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 37°С. Электрофорез белков проводили по методу Лэммли [27]. Спектр изоформ анализировали по активности в геле после электрофореза в неденатурирующих условиях [28]. Иммуноблотинг проводили по протоколу ECL Wectern blotting analis sistem "Amersham". Количество белка определяли по методу Лоури [29].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Зависимость эффективности секреции PhoA от белков SecB и SecA определяется первичной структурой экспорт-инициирующего домена зрелой PhoA
Ранее с помощью статистического анализа известных первичных структур N-концевых областей секретируемых белков и мутагенеза этой области PhoA был выявлен экспорт-инициирующий домен из 18 аминокислотных остатков [5, 6]. Замены аминокислотных остатков в этом домене вблизи участка отщепления сигнального пептида наиболее сильно подавляли эффективность сек-
Активность щелочной фосфатазы (мЕ/мг белка), кодируемой геном в составе плазмиды рБАР, в зависимости от содержания в клетках БесВ и активности БесА
Условия секреции Тип PhoA +SecB -SecB +SecB -SecB
+SecA -SecA
Природная PhoA PhoA К(2, 3) PhoA К(13, 14) 2746.5 ± 211 97.6 ± 23 2302.2 ± 344 1012.2 ± 256 95.2 ± 19 1027.3 ± 99 613.0 ± 20 26.0 ± 4 476.5 ± 27 299.3 ± 107 25.9 ± 4 273.0 ± 36
Примечание. Активность определяли в культуре клеток через 60 мин после индукции биосинтеза щелочной фосфатазы. Представлены средние значения пяти независимых опытов. +БесВ - штамм МС4100, -БесВ - штамм СК1953, +БесА - активный белок, -БесА - инактивирован 2 мМ азида натрия.
реции. По мере удаления от N-конца полипептидной цепи влияние замен на секрецию снижалось. Предполагается, что одна из причин влияния мутаций на эффективность секреции - нарушение взаимодействия экспорт-инициирующего домена с белками секреторного аппарата, в частности,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.