МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 547. (3458+4808+4808:541.49)
ВЗАИМОДЕЙ СТВИЕ БОР ФТОРИДНОГО КОМПЛЕКСА |а-МЕТИЛ-3,3,5,5'-ТЕТР АМЕТИЛ-4,4'-ДИСУЛЬФО-2,2'-ДИПИРРОЛИЛМЕТЕНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ И ЕГО БИЛИРУБИНОВЫМ КОМПЛЕКСОМ
© 2014 г. А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, Б.А. Кочергин, Е.В. Антина*
Ивановский государственный химико-технологическийуниверситет, 153460, Иваново, просп. Ф. Энгельса, 7
E-mail: evr@ismt.ru
* Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН, 153045, Иваново, А кадемическаяул., 1
E-mail: eva@isc-ras.ru Поступила в p едакцию 08.02.13 г.
Изучено взаимодействие борфторидного комплекса ц-метил-3,3',5,5'-тетраметил-4,4'-дисульфо-2,2'-дипирролилметена (BODIPY) с бычьим сывороточным альбумином и его билирубиновым комплексом в водном растворе методами флуоресцентной и электронной спектроскопии. Взаимодействие осуществляется путем статического тушения флуоресценции белка и имеет преимущественно гидрофобный и электростатический характер. Значения констант взаимодействия составили (61,2 ± 2,8)-103 и (6,51 ± 0,3)-103 M-1. Показано, что при взаимодействии с белками наблюдается гипсо- и батохромный сдвиг полосы поглощения BODIPY. C использованием теории резонансного переноса энергии определены расстояния донор-лиганд, которые составили 2,88 и 2,46 нм для бычьего сывороточного альбумина и его билирубинового комплекса соответственно. Применение синхронной флуоресцентной спектроскопии позволило выявить особенности влияния BODIPY на конформационные изменения белковых молекул. Установлено, что BODIPY эффективнее взаимодействует с альбумином по сравнению с его билирубиновым комплексом.
Ключевые слова: борфторидные комплексы дипирролилметенов, билирубин, альбумин, спектроскопия, межмолекулярные взаимодействия.
Борфторидные комплексы дипирролилметенов (БОВ1РУ), применяемые в качестве ограничителей мощного лазерного излучения, уже зарекомендовали себя как эффективные флуо-рофоры [1]. Описано большое число БОБ1РУ-меченных соединений [2], многие из этих зондов широко применяются в биологических исследованиях [3-5]. Благодар я относительно низкой биотоксичности ряда производных БОВ1РУ, данные соединения интересны в плане применения высокоинтенсивных меток на раковые клетки, а также в фотодинамической терапии раковых заболеваний. Изучение спектральных и фото физических свойств химических модификаций дипирролилметенов позволит р ешить проблему оптимального практического использования соединений данного класса.
Сокращения: BODIPY - борфторидные комплексы дипирролилметенов, BSA - бычий сывороточный альбумин, BR BSA - комплекс бычьего сывороточного альбумина с билирубином, АКО - аминокислотные остатки.
Следует отметить недостаточную изученность вновь синтезируемых BODIPY с точки зрения их биологической активности, о собенно при оценке их биодоступности, учитывая принципиальную возможность того, что при введении в организм BODIPY способны связываться с сывороточными белками. Сывороточные белки являются наиболее распро стр аненными белками в плазме крови [6,7]. Для многих соединений доказана способность к образованию конъюгатов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Универсальная транспор тная функция альбуминов позволяет использовать их в качестве удобных моделей для изучения даже слабых межмолекулярных взаимодействий [8]. Возникающие взаимодействия, вызывающие со -ответствующие изменения в белковых молекулах, можно проследить благодаря собственной (излучение остатков тр иптофана, Тгр) или наведенной (флуоресцентные зонды) флуоресценции [9]. Высокая чувствительность спектров флуоресценции к изменениям полярности среды (окружения) позволяет делать существенные вы-
воды о механизмах взаимодеиствия низкомолекулярных соединений с белковой молекулой. Это имеет важное диагностическое значение для исследования биомолекул (в число котор ы х входят BODIPY), п р ед ставляющих интер ес как потенциальные лекарственные п р епа р аты и др. [10]. Кроме того, тушение собственной флуо-р есценции альбуминов под действием веществ р азличной пр ир оды является о сновой разр абот-ки современных тест-систем по определению типа и способности низкомолекуляр ных соединений к взаимодействию с белками. Известно также, что тушение флуо р есценции белков низкомолекуляр ными соединениями широко изучается как фундаментальное явление, а также при решении биохимических проблем. Применение спектр о скопических методов может выявить р еакционную спо собность химических и биологических систем пр и низких концентр а -циях в физиологических условиях. Измерение тушения природной флуоресценции альбумина является важным методом для изучения его взаимодействия с р азными веществами, в ча ст -ности с BODIPY.
Одной из интересных особенностей альбумина является его способность к обр азованию макромолекулярных комплексов с билирубином - желчным пигментом, обр азующимся пр и р а спаде гема кр ови [11].
нению свойств как BODIPY, так и носителя, а также присоединенных к нему молекул.
В связи с этим на стоящее исследование напр авлено на выявление о собенностей взаимо -действия BODIPY с BSA и комплексами BSA с билир убином (BR BSA) с пр именением флуо -р есцентной спектр о скопии и спектр о скопии поглощения и пр извано во сполнить пр обел в отсутствии публикаций в данной области знаний.
ЭК СПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС ТЬ
В работе использованы бычий сывор оточный альбумин («Агат-Мед», Р о ссия, M = 66430,3 Да) мар ки «х.ч.»; BR -BSA-комплексы со става 1:1 («Агат-Мед», Ро ссия, M = 67014,9 Да) квалификации «х.ч.», свободные от глобулина и жирных кислот; BODIPY ц-метил-3,3',5,5'-тетр аметил-4,4'-дисульфо-2,2'-дипирролилметена динатрие-вая соль мар ки «х.ч.» (Invitrogen, США).
Билирубин
Р анее считавшийся токсичным соединением, в настоящее вр емя билирубин рассматр ивается как один из важнейших компонентов антиок-сидантной защиты организма [12-14]. Антиок-сидантная активность билирубина и его аналогов вызывает огр омный интер ес в связи с необходимостью поиска, молекуляр ного дизайна и и сследования антиоксидантной активности его эквивалентов - синтетических ди- и тетр а -пирролов, перспективных для использования в качестве лекарственных препаратов. Поэтому развитие экспериментальных и теоретических напр авлений химии билир убина становится актуальной задачей. В частности, пр исоединение ВОБТРУ к белку неизбежно приведет к изме-
BODIPY
Все экспер именты пр оводили в водных р а створах.
Спектры флуоресценции растворов исследуемых соединений регистрировали на спектр офлуор иметр е (пр ибор для измер ения свечения) «Cary ЕсПрзе» (Varian-Agilent, США-Австралия), управляемого с персонального компьютер а пр и помощи пр огр аммного комплекса Сагу ЕсПрзе Scan Application 1.1.
Эмиссионные спектр ы регистр ир овали в диа -пазоне длин волн 290-750 нм, длина волны возбуждения (À0) составляла 280 нм. Спектры син-хр онной флуор есценции снимали в диапазоне длин волн 190-750 нм при разнице в длинах волн возбуждения и эмиссии AÀ 15 и 60 нм. Скор о сть снятия спектр ов составляла 1200 нм/мин пр и напр яжении детекто р а в 600 В. Ши-р ина щелей возбуждения и эмиссии во всех случаях со ставляла по 5 нм. Все экспер именты пр о -водили в термостатируемой ячейке с Пельтье-модулем пер ено са тепла PTC-2 пр и темпер атур е 298 ± 1 К. Коррекция спектр ов флуо р есценции осуществлялась в автоматическом режиме при помощи квар цевого диффузо р а.
Электр онные спектр ы поглощения исследуемых р аствор ов р егистр ир овали в диапазоне
Рис. 1. Спектры эмиссионной флуоресценции BSA ([BSA]x106, моль-л-1, кривые 1 - 5: 2,73; 3,74; 7,42; 11,8; 14,9) при T = 298 K (а) и соответствующая зависимость интенсивности эмиссии на максимуме флуоресценции от концентрации BSA (б).
длин волн 190-800 нм на спектрофотометре CФ-104 («Аквилон», Россия), управляемом с персонального компьютера при помощи про -граммного комплекса UVWin 5.1.0. И сследова-ния проводили в кварцевых кюветах с толщиной светопоглощающего слоя в 1 см.
Аппроксимацию спектр ов поглощения и флуоресценции проводили с помощью про -грамм Origin Pro 8.5 и MagkPlot Pro 1.4.1. Интегр ир ование спектров проводили численно с помощью программы MathCad 14. Обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием программного пакета MiCTosoft Off^e Ехсе1 2010.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Максимумы эмиссии (Afl) BSA и BRBSA приходятся на 336 нм (р ис. 1а) и обусловлены доминирующим вкладом остатков триптофана (Ад = 348 нм). П ри одинаковой молярной концентрации растворов BSA и BRBSA интенсивность флуоресценции последнего в 2,5 раза ниже. Таким образом, при взаимодействии альбумина с билирубином часть энергии флуоро-фора «рассеивается» на практически не излучающий пигмент, и флуоресценция белка в со -ставе BR BSA уже частично потушена за счет комплексообразования с билирубином, а также за счет взаимодействия BR-Тгр. Зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации BSA и BRBSA (рис. 1б) позволили опр еделить предельное значение их содержания, до которого не наблюдается концентрационного тушения, вызванного собственными ассоциативными процессами. Для BSA и BRBSA такая концентрация составила ~1,75-10-5 М.
В ходе титр ования р аствор а БОБ1РУ (рис. 2а) раствором альбумина наблюдаются гипо- и батохромный сдвиги максимума поглощения БОВ1РУ с уширением пика. Такие изменения вызваны увеличением поляризации хромофор а за счет его взаимодействия с белковой молекулой. Гипохромное смещение объясняется появлением в растворе комплексов БОБ1РУ-альбумин, в котор ом хромофор находится в более упорядоченной форме по ср авнению со свободным со стоянием. Аналогичная ситуация наблюдается в пр оцессе добавления альбумина к р аствору БОБ1РУ (рис. 2б). Таким обр азом, между БОБ1РУ и ББЛ происходит взаимодействие, количест-венные характеристики которого были определены с использованием флуоресцентной спектр оскопии. Добавление альбумина (рис. 3а) вызывает тушение флуоресценции БОВ1РУ более чем в тр и раза. Дальнейшее увеличение концентрации альбумина вызывает практически полное тушение флуоресценции пигмента. Аналогичные изменения происходят для БИББЛ, з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.