УДК 577.29
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК-АПТАМЕР/БЕЛОК КАК ПРИЧИНА АПОПТОЗА И ОСТАНОВКИ ПРОЛИФЕРАЦИИ В КЛЕТКАХ АСЦИТНОЙ
КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА
© 2013 г. О. С. Коловская1, 2, Т. Н. Замай1, 2*, А. С. Замай1, Ю. Е. Глазырин1, Е. А. Спивак1, О. А. Зубкова1, 2, А. В. Кадкина1, Е. Н. Еркаев1, Г. С. Замай1, А. Г. Савицкая1, Л. В. Труфанова1, Л. Л. Петрова1, М. В. Березовский3
1Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; *электронная почта: tzamay@yandex.ru 2Сибирский федеральный университет, 660049, Красноярск, пр. Свободный, 79 3Университет Оттавы, Марии Кюри 10, Оттава, K1N 6N5, Канада Поступила в редакцию 08.05.2013 г.
В последнее время появились новые возможности использования одноцепочечных ДНК и РНК в качестве терапевтических средств. Олигонуклеотиды, которые, благодаря своей строго определенной третичной структуре и пространственному распределению зарядов, с высокой аффинностью и специфичностью связываются со своими мишенями, получили название аптамеров. Аптамеры могут быть подобраны к любым молекулам, вирусным частицам, бактериям, клеткам и тканям, они имеют широкий спектр применения — от идентификации мишени до доставки к ней лекарственных препаратов. Сами аптамеры могут влиять на различные клеточные функции, воздействуя на определенные белки и рецепторы. В настоящей работе показана принципиальная возможность селекции аптамеров, проявляющих противоопухолевую активность в культурах опухолевых клеток, и идентификации их белковых мишеней с помощью масс-спектрометрического анализа. Так, полученный в ходе селекции аптамер AS-14 (Kd = 3.8 нМ) был способен вызывать апоптоз (транслокацию фосфатидилсерина, определенную с помощью Annexin V Alexa Fluor 488), а AS-9 (Kd = 0.75 нМ) останавливал пролиферацию (установлено с помощью CellTrace™ Far Red DDAO-SE) в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения идентифицированы белки, на которые воздействуют аптамеры AS-14 и AS-9. Одной из вероятных мишеней AS-14 оказался филамин-А, вовлеченный в пролиферацию опухолевых клеток, образование метастазов и прогрессию опухолей. Аптамер AS-9, как следует из данных масс-спектрометрического анализа, взаимодействует с а-субъединицей митохондриальной АТР-синтазы, ключевого компонента системы окислительного фосфорилирования митохондрий, стимуляция которой приводит к подавлению опухолевого роста. Таким образом, данные масс-спектрометрии подтверждают результаты, согласно которым аптамеры, связываясь с определенными белковыми мишенями, приводят к апоптозу и остановке пролиферации опухолевых клеток. Однако механизмы действия аптамеров in vitro и их возможные эффекты in vivo до конца не ясны и нуждаются в дальнейшем изучении. Результаты нашей работы открывают новые возможности для создания на основе ДНК-аптамеров нетоксичных препаратов для адресной терапии онкологических заболеваний.
Ключевые слова: ДНК-аптамеры, асцитная карцинома Эрлиха, противоопухолевый эффект, пролиферация, апоптоз, белковые мишени аптамеров, масс-спектрометрия.
Б01: 10.7868/8023347551305006Х
В последнее время в качестве лекарственных препаратов начинают использовать биофармацевтические средства на основе аптамеров, выполняющих роль искусственных антител. Аптамеры представляют собой фрагменты одноцепо-чечной (оц) РНК или ДНК, которые, благодаря уникальным трехмерным структурам и простран-
ственному распределению зарядов, способны с высокой аффинностью и селективностью связываться с функциональными группами своих биологических мишеней [1]. Аптамеры часто рассматривают как синтетические аффинные аналоги белковых антител, имеющих широкий спектр применения — от идентификации мишени до до-
ставки к ней лекарственных средств. Олигонук-леотиды обладают рядом преимуществ, одно из которых — возможность химического синтеза и различных модификаций функциональных групп. Аптамеры с требуемой аффинностью и селективностью можно подобрать как к одиночным молекулярным мишеням, так и к сложным биологическим объектам [2—6]. Показано, что аптамеры к различным линиям опухолевых клеток могут проявлять противоопухолевую активность как сами по себе, так и в комплексе с токсинами [7]. Взаимодействуя с молекулярными мишенями, апта-меры могут изменять функциональное состояние клетки [8]. Кроме того, они обладают такими важными для лекарственных средств свойствами, как неиммуногенность и нетоксичность [9].
В нашей работе описан комплексный подход к разработке новых лекарственных средств на основе аптамеров. Этот подход включает селекцию пула аптамеров к клеткам асцитной карциномы Эрлиха, оценку биологического эффекта индивидуальных аптамеров и определение белковых мишеней аптамеров, обладающих противоопухолевым эффектом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Селекция аптамеров. В качестве объекта для селекции использовали клетки асцитной карциномы Эрлиха, выделенные из брюшной полости мышей линии ICR на 9-е сутки после их внутри-брюшинной трансплантации. Клетки крови, ткани печени, почек, селезенки выделяли у мышей без опухоли. Манипуляции с животными проводили в соответствии с рекомендациями Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health. Проведение работы одобрено этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого. Селекцию аптамеров к клеткам асцитной карциномы Эрлиха проводили методом систематической эволюции ли-гандов экспоненциальным обогащением (SELEX) из оцДНК-библиотеки аптамеров. Первый раунд начинали с библиотеки N40 (Integrated DNA Technologies, США), содержащей оцДНК, в которых центральные 40 нуклеотидов были рандоми-зированы и фланкированы двумя стандартными последовательностями для связывания прайме-ров при амплификации (5'-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG N40 GC ATA GGT AGT CCA GAA GCC-3'). Перед каждым раундом селекции и другими экспериментами оцДНК-библиотеку или пул денатурировали в течение 5 мин при 95°C, после чего ренатурировали на льду в течение 10 мин. Все опыты с клетками проводили в бесцветном фосфатном буфере (DPBS) (Sigma-Aldrich, США) или бесцветной среде Хенкса (Sigma-Aldrich, США). В каждом раунде селекции использовали 1 млн. клеток, разведенных в фосфатном буфере.
Проводили 10 раундов селекции, включающих: (1) инкубацию исходной библиотеки аптамеров в первом раунде селекции (1 мкМ) или пула аптамеров (100 нМ), полученного в предыдущем раунде, с негативными мишенями (клетки крови, ткани печени, почек и селезенки); (2) удаление с помощью центрифугирования из пула ДНК-оли-гонуклеотидов, связавшихся с негативными мишенями, и сбор свободных аптамеров в суперна-танте; (3) инкубацию пула аптамеров с клетками асцитной карциномы Эрлиха; (4) отмывку клеток от несвязавшейся ДНК; (5) экстракцию связанных с клетками ДНК-аптамеров с помощью денатурации и центрифугирования; (6) амплификацию пула аптамеров с помощью симметричной и асимметричной ПЦР. Клетки асцитной карциномы с целью уменьшения неспецифического связывания с ними ДНК, начиная с 5-го раунда селекции и в каждом последующем, преинкубиро-вали с маскирующей ДНК (salmon sperm scrambled DNA; 0.1 мг/мл). Для проведения симметричной ПЦР использовали 5 мкл пула аптамеров в трис-EDTA буфере (рН 7.4) и 45 мкл реакционной смеси, содержащей: однократный буфер для ПЦР; 2.5 мМ MgCl2; 0.025 Ед/мкл KAPA2G HotStart Robust polymerase (KAPABiosystems, США); 220 мкМ dNTP; 300 нМ прямого праймера (5'-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3') и 300 нМ обратного праймера (5'-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3') (Синтол, Россия). Асимметричную ПЦР проводили с 5 мкл симметричного ПЦР-продукта и 45 мкл асимметричной ПЦР-смеси: 1 х ПЦР-буфер; 2.5 мМ MgCl2; 0.025 Ед/мкл KAPA2G HotStart Robust polymerase; 220 мкМ dNTP; 1 мкМ прямого праймера с меткой Alexa-488 (5'-Alexa488-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3'), и 50 нМ обратного праймера (5'-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3'). Амплификацию проводили по следующей программе: предварительный нагрев — 2 мин при 95°C; 15 циклов по 30 с при 95°C; 15 с при 56.3°C и 15 с при 72°C. Наличие ПЦР-продукта контролировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Для дальнейшего использования пулы аптамеров очищали с помощью 30 кДа cut off фильтров Pall Centrifugal devices (Pall, США). Концентрацию оцДНК-аптамеров определяли на спектрофотометре NanoVue plus (GE Healthcare, Life Sciences, США). В результате получали аптамеры с флуоресцентной меткой Alexa-488. Технология cell-SELEX схематично представлена на рис. 1.
Анализ аффинности аптамеров к асцитным клеткам. Аффинность и специфичность аптамеров к асцитным клеткам карциномы Эрлиха оценивали с помощью проточной цитометрии на цитометре FC-500 Flow Cytometer (Beckman Coulter Inc., США). Перед инкубацией с аптамерами клетки асцитной карциномы для уменьшения неспецифического связывания инкубировали с маскирующей ДНК (0.1 мг/мл ДНК спермы лосося) в те-
2. Сбор несвязанной ДНК
Исходная библиотека ДНК-аптамеров
Пул ДНК-аптамеров Рис. 1. Схема селекции ДНК-аптамеров к асцитным клеткам мышиной карциномы Эрлиха.
чение 15 мин при 19—24°С. Далее каждый образец, содержащий 250 000 клеток, инкубировали в 500 мкл 100 нМ раствора аптамеров в среде Хенк-са в течение 30 мин при 37°С, затем клетки отмывали от несвязавшихся последовательностей. В качестве контроля использовали флуоресцентно меченную исходную библиотеку аптамеров. Все образцы ресуспендировали в 0.5 мл среды Хенкса и использовали для анализа связывания аптамеров с клетками, регистрируя 30000 событий для каждой пробы. Флуоресценцию, превышающую базовую флуоресценцию интактных клеток, считали истинной флуоресценцией аптамеров с меткой А1еха-488, связанных с асцитными клетками. Для определения констант диссоциации (Кй) 50 000 клеток асцитной карциномы Эрлиха титровали 0, 5, 10, 25, 50 или 100 нМ аптамеров в фосфатном буфере с магнием и кальцием, строили графики зависимости связывания ДНК-аптаме-ров с клетками. Хй определяли как концентрацию ДНК, соответствующую половине
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.