БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 2, с. 169 - 176
УДК 577.24
Академику В.П. Скулачеву посвящается
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДРОЖЖЕВЫХ МИТОХОНДРИЙ С ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ И МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННЫМИ ЛИПОФИЛЬНЫМИ КАТИОНАМИ
© 2010 г. Е.И. Суханова, Т.А. Тренделева, Р.А. Звягильская*
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33; факс: (495)954-2732, электронная почта: renata_z@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 05.11.09
Исследовано влияние жирных кислот и митохондриально-направленных липофильных катионов с делока-лизованным зарядом (SkQ1, SkQ3, MitoQ и C12TPP) на прочно сопряженные митохондрии из дрожжей Dipodascus (Endomyces) magnusii и Yarrowia lipolytica. Найдено, что жирные кислоты (насыщенные и ненасыщенные) в микромолярных концентрациях снижали мембранный потенциал, который полностью восстанавливался добавлением БСА и ATP. Митохондриально-направленные липофильные катионы в низких микромолярных концентрациях являются «относительно слабыми» разобщителями, в более высоких концентрациях ингибируют дыхание, в еще больших концентрациях вызывают набухание митохондрий за счет, вероятно, их прооксидантного и детергентного действия. В очень низких, еще не разобщающих концентрациях липофильные катионы усиливают разобщающее действие насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Высказано предположение о том, что выявленное разобщающее действие липофильных катионов может быть, по крайней мере отчасти, объяснено их взаимодействием с эндогенным пулом жирных кислот.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дрожжи, Yarrowia lipolytica, Dipodascus (Endomyces) magnusii, митохондрии, жирные кислоты, SkQ1, SkQ3, MitoQ, C12TPP, дыхание, мембранный потенциал, набухание.
Существует более 300 теорий старения [1]. Однако наиболее популярной до сих пор остается свободнорадикальная теория старения, согласно которой старению и патологиям, связанным со старением, способствует окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода (АФК) [2]. Действительно, многочисленные данные свидетельствуют о том, что с возрастом происходит накопление окислительных изменений в ДНК, особенно в митохондриаль-ной ДНК (мДНК), белках и липидах [3]. Поскольку мДНК кодирует белки, входящие в состав электронтранспортной цепи и АТР-синтаз-ного комплекса митохондрий, окислительный
Принятые сокращения: А^ — трансмембранная разность электрических потенциалов, АФК — активные формы кислорода, С12ТРР — додецилтрифенилфосфоний, КЦХФ — карбонилцианидхлорфенилгидразон, МкоР — 10-(6'-убихинонил)децилтрифенилфосфоний, 8кр1 — 10-(б'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний, 8кр3 — 10-(5-метилпластохинонил)децилтрифенилфосфоний, ЦТАБ — цетилтриметиламмонийбромид. * Адресат для корреспонденции.
стресс, связанный со старением, должен сопровождаться серьезными нарушениями в энергопродукции, что неизбежно должно приводить к угасанию жизненноважных функций организма. Кроме того, АФК часто являются индукторами гибели клеток по механизму апоптоза или некроза.
Неудивительно, что исследователями неоднократно предпринимались попытки замедлить старение с помощью антиоксидантов [3]. Наиболее успешным с этой точки зрения оказалось использование МкоР — положительно заряженного (следовательно, транспортирующегося исключительно в митохондрии) липофильного катиона трифенилфосфония, соединенного С10-алифатической цепью с убихиноном, компонентом электронтранспортной цепи митохондрий, обладающего антиоксидантной активностью (см. обзор [4] и ссылки в нем). Митохо-нондриально-направленные липофильные ан-тиоксиданты имеют существенные преимущества перед другими антиоксидантами, поскольку они транспортируются в клетки и митохонд-
рии в соответствии с величиной мембранного потенциала, генерируемого соответственно на цитоплазматической и митохондриальной мембранах, благодаря чему их концентрация в митохондриях может увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет использовать их в низких, нетоксичных, наномолярных и субнаномо-лярных концентрациях. Более того, липофиль-ные антиоксиданты, накапливаясь в липидном бислое внутренней митохондриальной мембраны, могут восстанавливаться (регенерироваться) компонентами дыхательной цепи, что обеспечивает их многократное функционирование.
В.П. Скулачев (см. обзоры [3, 5] и ссылки в них) предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на потенциально более мощный природный антиоксидант плас-тохинон, функционирующий в фотосинтетической цепи переноса электронов (в хлороплас-тах) в условиях повышенной концентрации кислорода и увеличенной продукции АФК. В рамках руководимого им проекта были синтезированы различные производные пластохинона (под общим названием SkQ, где Sk означает проникающий катион, «Skulachev's ion» — термин, введенный Д. Грином [6], а Q — пластохи-нон) [3, 5, 7]. Показано, что катионные производные пластохинона свободно проникают через бислойные липидные мембраны с образованием диффузионного потенциала расчетной величины [3, 7]. Они накапливаются в митохондриях клеток и предохраняют их от апоптоза или некроза, вызванного АФК [3, 7], снижают уровень перекисного окисления липидов и белков у стареющих животных [3, 8], продлевают жизнь подоспоры, дафний, дрозофилы и мышей [3, 9], оказывают положительный терапевтический эффект при различных возрастных заболеваниях, таких как инфаркты сердца и почек, сердечная аритмия, инсульт головного мозга [10], некоторые формы рака [11], заболевания глаз (катаракта, ретинопатия, глаукома, увеит) и др. [8]. Причем на ряде биологических моделей показано преимущество использования SkQ по сравнению с MitoQ, поскольку, как первоначально и предполагалось В.П. Скулачевым, у SkQ интервал концентраций, в которых антиоксидантная активность преобладает над прооксидантной, был существенно шире, чем у MitoQ.
Изучение механизма действия производных SkQ на целых организмах затруднено сложностью самих объектов исследования. Наиболее простой и в то же время адекватной моделью для изучения механизма их действия остаются митохондрии. При изучении действия биологически активных веществ на уровне митохондрий, прочно сопряженные митохондрии дрожжей
имеют некоторые преимущества по сравнению с митохондриями животных, поскольку они практически лишены эндогенного дыхания, что позволяет исследовать скорости окисления индивидуальных субстратов окисления, и, как мы показали [12], не имеют Са2+/Рн-зависимых пор, что облегчает интерпретацию полученных данных. Используя прочносопряженные митохондрии дрожжей У. \ipolytica и Б. шалаши, мы показали, что в зависимости от использованных концентраций производные 8кр (8кр1, 8кр3, МкоР и С12ТРР) оказывают антиоксидантное, разобщающее, прооксидантное и детергентное действие. В низких концентрациях производные 8кр усиливают разобщающее действие жирных кислот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты. В работе использованы ADP, ATP, UDP, GTP, GDP, пируват, малат, сукцинат, паль-митат, БСА (свободный от примеси жирных кислот), аламецитин, атрактилозид, сафранин О, карбонилцианидхлорфенилгидразон (КЦХФ), ЭДТА, ЭГТА, Tris, сорбит, маннит («Sigma», США); кумасси бриллиантовый голубой G-250, зимолиаза Т-20 («MP», США); ЕТН129 («Fluka», Германия); дрожжевой экстракт, («Difco», США); остальные реактивы отечественного производства марок «хч» и «осч».
Организмы и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Y. lipolytica (Wick.) van der Walt & Arx, полученные из эпифитной микрофлоры листьев пустынных растений (пустыня Негев, Израиль) и идентифицированные на основании совокупности морфологических, физиологических, биохимических, хемотаксоно-мических характеристик и молекулярно-генети-ческого анализа как анаморфа Y. lipolytica [13], а также D. magnusii штамм ВКМ 261. Клетки выращивали в 750-мл колбах Эрленмейера (рабочий объем 100 мл) в полусинтетической среде [14], содержавшей в качестве источника углерода и энергии 1% сукцинат (для Y. lipolytica) или 1% глицерин (для D. magnusii), при 28° на роторной качалке (220 об/мин).
Выделение митохондрий из дрожжей Y. lipoly-tica и D. magnusii проводили по методикам, разработанным в нашей лаборатории и описанным ранее (соответственно [12] и [15]) с небольшими модификациями.
Полученные митохондриальные препараты были полностью активны в течение, по крайней мере, 4 ч после выделения (при хранении на льду).
Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий
объем 1 мл) c закрытым электродом типа Кларка. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфашый буфер, рН 7,3—7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).
Потенциал, генерируемый на внутренней мито-хондриальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman Coulter DU-650 (США), используя двуволновой режим (511—533 нм) с сафранином О в качестве потенциалзависимого зонда [16]. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2—7,3, 20 мМ сукцинат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл).
Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) по уменьшению оптической плотности митохонд-риальной суспензии при 540 нм.
Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд [17] с БСА в качестве стандарта.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В работе использовали прочно сопряженные митохондриальные препараты, выделенные из дрожжей У. \ipolytica и Б. шалаши. Они окисляли добавленные NAD-зависимые субстраты с высокими скоростями (рис. 1), высокими (рекордными) величинами дыхательного контроля [18] и значениями отношения АБР/О, близкими к теоретически ожидаемым. На рис. 1 видны многочисленные переходы из состояния дыхания 4 (до добавления АБР) в состояние 3 (после добавления АБР) и спонтанный выход в состояние 4 после фосфорилирования добавленного АБР.
Митохондриальные препараты в присутствии экзогенных субстратов поддерживали неизменным Лу в течение длительного времени (10—15 мин) и не набухали даже в гипотонической среде, приготовленной на основе маннита как основного осмотического стабилизатора. Отсутствие набухания не было связано со структурными ограничениями, поскольку добавление аламецити
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.